2008年 · 第46卷第07期

目的 建立以T细胞受体β链(TCRβ)基因重排为分子标志定量检测儿童急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)微小残留病(MRD)的实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测体系。 方法 应用BIOMED-2欧洲协作组设计的PCR检测体系，检测26例初发T-ALL患儿的TCRβ基因重排，并进行序列分析与比对。对其中6例患儿根据基因重排后连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)引物，结合胚系TaqMan探针与引物，建立RQ-PCR检测方法，行缓解期标本MRD定量追踪检测。 结果 92.3%的T-ALL患儿可检测到克隆性TCRβ基因重排[84.6%具有Vβ-(Dβ)-Jβ完全重排，50%具有Dβ-Jβ不完全重排]。通过序列分析，V片段使用频率最高的家族为BV5、BV6，J区使用频率最高的家族为Jβ2.7, J1.3、 J2.4、 J2.6未被使用。6例患儿ASO标准曲线的斜率为-3.54~-3.37，截距为19.35~20.51，相关系数>0.98。定量范围均达到10-4。对随访期标本MRD检测发现，复发患儿的MRD水平在复发前显著升高。 结论 以TCRβ基因重排为分子标志对T-ALL患儿行MRD定量检测，具有较高的敏感度和特异性，动态追踪检测随访期标本MRD水平具有重要的临床价值。

目的 采用本院自行研制的ZCH-4-2E8细胞分泌的抗人CD19单克隆抗体与去甲斑蝥素(NCTD)进行连接制备免疫毒素，研究其在体外的靶向杀伤作用。 方法 通过凝胶过滤层析法纯化2E8单抗，SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度；活泼酯法制备免疫毒素2E8-NCTD；流式细胞仪测定免疫毒素的抗体活性及Nalm-6细胞和K562细胞上CD19抗原表达情况；台盼蓝计数法比较2E8抗体、NCTD、2E8-NCTD免疫毒素对Nalm-6细胞和K562细胞的杀伤作用。 结果 纯化后的2E8单抗经SDS-PAGE鉴定纯度达99.00%以上；2E8培养上清在Nalm-6细胞上的阳性率为99.34%，而在K562细胞上则为0.98%，2E8-NCTD免疫毒素与Nalm-6细胞的阳性反应率为99.90%；培养96 h时，与对照组相比，2E8-NCTD(10 μg/ml)对CD19＋的Nalm-6细胞的生长影响有统计学意义(96 h抑制率71.25%，P<0.001)，而纯化的2E8抗体(10 μg/ml)对Nalm-6细胞生长则无明显抑制作用(96 h抑制率为30.29%，P>0.05)；10 μg/ml 2E8抗体、10 μg/ml 2E8-NCTD对CD19-的K562细胞(96 h抑制率分别为4.17%和15.41%)则无明显抑制作用(P>0.05)。 结论 成功制备2E8-NCTD免疫毒素，该免疫毒素在体外具有明显的靶向杀伤白血病细胞Nalm-6的作用。

目的 对中南大学湘雅医院、广西医科大学第一附属医院急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿的治疗结果及影响无事件生存率(EFS)的因素进行分析。 方法 所有病例均采用中华医学会儿科学分会血液学组1998年第二次修正的小儿ALL诊疗建议(简称荣成方案)化疗，采用Kaplan-Meier方法评估依从治疗的188例患儿EFS，组间患儿EFS差异用Log-rank检验，用COX比例风险模型分析独立因素对EFS的影响。 结果 374例接受诱导治疗儿童的完全缓解(CR)率为93.6%(354例)，全程依从治疗的188例ALL的5年EFS为(68.1±5.6)%，标危、高危组5年EFS分别为(75.2±6.0)%、(47.6±11.6)%；总复发率为10.6%，复发的中位时间为13个月；188例患儿中共有29例死亡，死亡率15.4%；化疗相关死亡13例(7.0%)。危险度分组、t(9; 22) /bcr-abl融合基因和白细胞计数为独立的不良预后因素。 结论 两家医院通过荣成方案治疗儿童ALL的总EFS接近70%，需要进行更加详细的危险因素评估和分组，降低治疗相关死亡率，提高儿童ALL治疗的依从性，以进一步提高EFS。

目的 了解肠道病毒71型首发肺水肿或肺出血的暴发性致死性的临床特征。 方法 回顾分析3例的临床表现，化验检查，诊断，治疗转归等。 结果 此3例均死亡，病初仅有发热、呕吐等非特异性症状，均无手足口臀部皮疹，发病后1~2 d病情迅速恶化，突发口唇发绀，呼吸急促。3例均误诊，因考虑感染性休克而扩容。均未能早期认识肺出血，直至出现口鼻吐血性液、全身发绀等才行气管插管，气管内均见大量血性泡沫液。3例血糖显著升高和肌张力降低，2例心动过速，1例高血压。3例胸片双侧或单侧渗出性病变，心影不大，3例外周血白细胞均升高，3例咽拭子、气管分泌液和1例脑脊液样本均检测到肠道病毒71型。 结论 婴幼儿首发肺水肿或肺出血患儿，符合肠道病毒71型感染特点，发生神经源性肺水肿或肺出血，急诊医生对该类疾病认识和处理不足。婴幼儿病初仅发热伴呕吐，数天后突发口唇发绀，呼吸急促，心动过速，高血压或低血压，肌张力低下，应高度怀疑该病，警惕肺水肿、肺出血。及时告知预后不良，扩容将迅速加剧病情恶化，应严格控制液体，早期气管插管正压通气，积极心功能支持。

目的 分析小儿原发性膀胱输尿管反流(VUR)的发病情况、肾损害评价、预后等临床资料。 方法 回顾性分析974例尿路感染患儿中的139例小儿原发性VUR患儿的反流发生情况、肾瘢痕形成、尿路B超、尿微量蛋白、预后等临床资料。 结果 尿路感染患儿中VUR发生率为14.3%(139/974)。婴幼儿期(<2岁)发生率最高为17.2%(79/458)，139例患儿中79例(56.8%)患儿年龄<2岁，且男性所占比例高于女性(P＝0.001)。轻度(Ⅰ-Ⅱ级)、中度(Ⅲ级)、重度(Ⅳ-Ⅴ级)反流所占比例分别为19.7%(41/208)、35.6%(74/208)、44.7%(93/208)。VUR患儿中肾瘢痕发生率为37.0%(50/135)，在不同年龄段中婴儿期(<1岁)发生率最高(42.4%)。50例肾瘢痕患儿中30例(60.0%)年龄在2岁之内，随着反流级别加重，发生肾瘢痕危险性亦提高(P<0.05)。尿路B超诊断VUR的灵敏度与特异度分别为24.8%、94.3%。疾病急性感染期尿微量蛋白的升高与肾瘢痕形成无明显相关性(P>0.05)。31例随访患儿中有90%尿路感染控制，44.4%患儿反流消失，57.1%患儿肾瘢痕好转，无肾功能进行性恶化病例。 结论 小儿原发性VUR需要及早诊断与治疗，并同时对肾损害作出正确评估，只有坚持长期的正规治疗与长期随访，才能有效保护肾脏，防止肾瘢痕的形成。

目的 建立快速检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)耐药性的实验方法并应用于临床以了解MP耐药现状。 方法 应用巢式PCR直接检测咽拭子标本MP-23S rRNA基因并对扩增产物进行电泳检测或DNA测序分析；通过MP培养及体外药物敏感性试验测定临床分离株的红霉素最小抑菌浓度，以验证23S rRNA基因检测结果的可靠性。 结果 200例临床标本经MP-IgM抗体、咽拭子MP种特异性16S rRNA基因巢式PCR扩增和MP分离培养测定证实为MP 64例。应用巢式PCR技术扩增MP-23S rRNA基因，并对扩增产物进行测序，将基因序列与基因库中MP标准株基因序列进行比较，与标准株序列相同的共计26例，其余38例存在23S rRNA点突变：35例在2063位点发生了A到G的点突变，1例在2063位点有A到C的点突变，2例在2064位点有A到G的点突变；耐药率为59.4%。MP耐药基因检测方法灵敏度达102 ccu/ml，MP培养及药物敏感性试验证实23S rRNA基因检测结果可靠。 结论 建立的MP耐药基因检测方法能直接检测临床标本中的MP耐药基因。59%的受检标本23S rRNA基因发生点突变。

目的 了解异戊酸血症患儿的临床、实验室特点以及异戊酰辅酶A脱氢酶(IVD)基因突变情况。 方法 对1例异戊酸血症患儿的病史、实验室检查以及血串联质谱和尿气相色谱质谱结果进行了分析，对IVD基因12个外显子及两端内含子行PCR扩增和DNA测序，限制性内切酶片段长度多态性分析c.466G>C (G127A)新突变。 结果 患儿男，2岁7个月，生后3 d起出现呕吐和酸中毒，行幽门切开术后仍反复呕吐，伴有酸中毒发作，智力发育明显落后。血串联质谱分析显示C5酰基肉碱水平增高至12.89 μmol/L，尿气相色谱质谱分析显示异戊酰甘氨酸明显升高，临床诊断为异戊酸血症。IVD基因DNA测序显示，患儿存在复合杂合突变：c.149G>A(R21H)和c.466G>C(G127A), c.466G>C(G127A)突变在IVD基因第5外显子上，是以往未报道的新突变。 结论 报道1例异戊酸血症，新生儿期发病，反复呕吐，酸中毒和智力落后，血C5酰基肉碱明显升高，尿中有异戊酰、甘氨酸大量排出，基因诊断发现1个IVD基因新突变。

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)侵犯新生儿外周血单个核细胞(PBMC)后，对新生儿免疫功能的影响，了解其免疫失败发生的机理。 方法 聚合酶链反应法(PCR)检测67对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性孕妇及其新生儿血清和PBMC的HBV DNA。根据新生儿PBMC中HBV DNA分成阴性和阳性组，将新生儿的PBMC分别在植物血凝素(PHA)和纯化HBsAg刺激下进行体外细胞培养，检测培养上清液中干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)的分泌含量。 结果 (1)35例母亲PBMC HBV DNA阳性者其新生儿15例为阳性，母亲与患儿PBMC HBV DNA阳性，差异有显著统计学意义(P<0.01)。(2)新生儿PBMC内HBV DNA阳性组与阴性组比较，纯化HBsAg刺激时，阳性组IFN-γ的分泌量较阴性组低(P<0.01), IL-4含量显示PBMC HBV DNA阳性组高于阴性组(P<0.05)，PHA刺激时，两组IFN-γ、IL-4含量差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 PBMC内的HBV DNA可能是HBV母婴垂直传播的一条重要途径；宫内新生儿PBMC感染HBV，IFN-γ特异性反应低下，而IL-4特异性反应增强，细胞调节失衡，可能是新生儿免疫失败和易于免疫耐受的一个重要原因。

目的 探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导途径在哮喘气道重塑过程中的作用；IL-1β是否通过JNK信号途径参与哮喘气道重塑形成过程。 方法 SD大鼠随机分为对照组(C)和哮喘组(A)，以卵白蛋白致敏和激发复制哮喘气道重塑模型，A组根据激发时间不同，分为4、8、12周组(分别为A4、A8、A12组)，同时设立相应C组(分别为C4、C8、C12组)。电镜观察肺组织超微结构变化，图像分析技术测定支气管壁厚度(Wat)和平滑肌厚度(Wam)；ELISA法测定血清、BALF中IL-1β浓度；免疫组化(IHC)检测肺内磷酸化JNK(P-JNK)及其下游物磷酸化c-Jun蛋白表达；Western Blot检测肺匀浆JNK磷酸化水平，对Wat、Wam与P-JNK蛋白平均吸光度值(mA)、P-JNK蛋白(mA)与血清、BALF IL-1β浓度进行直线相关分析。 结果 4、8、12周A组Wat、Wam均相应地高于4、8、12周C组(均P<0.01)，12周时，A组二者均高于4周、8周(均P<0.01)；各哮喘组血清、BALF IL-1β浓度均高于同时期C组(均P<0.01)，A组BALF中IL-1β浓度，12周时，高于4周、8周(P<0.05或P<0.01)，血清中IL-1β浓度，三者差异无统计学意义；P-JNK及其下游物P-c-Jun(mA值)，各哮喘组均高于同时期C组(均P<0.01)，12周时，A组二者均高于4周、8周(均P<0.01)；Western Blot检测P-JNK蛋白吸光度值(A值)，各哮喘组均高于同时期C组(均P<0.01)，A组中12周高于4周(P<0.01),与8周组差异无统计学意义(P>0.05)；Wat、Wam与P-JNK(mA)均呈高度正相关(分别为r＝0.823、r＝0.818，均P<0.01)；P-JNK mA与血清、BALF IL-1β浓度均呈高度正相关(分别为r＝0.717、r＝0.803，均P<0.01)。 结论 P-JNK及其下游物P-c-Jun在哮喘大鼠气道重塑过程中表达增高，提示JNK信号通路在气道重塑进程中起重要作用；IL-1β可能部分通过激活JNK信号转导途径，参与哮喘气道重塑形成过程。

目的 探讨高氧致慢性肺疾病(CLD)早产鼠的肺组织HoxB5基因表达规律及其对肺发育抑制的影响机制。 方法 将孕21 d剖宫取出的新生鼠(即早产鼠)80只随机分为实验组及对照组(每组均为40只)，采用高浓度氧诱导早产鼠CLD模型，分别于实验后1、3、7、14、21 d采集肺组织，应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等技术，测定肺组织HoxB5 、AQP-5、SP-B mRNA水平，并同期观察肺发育的评价指标放射状肺泡计数(RAC)的变化。 结果 生后1 d和3 d，实验组和对照组的HoxB5 、AQP-5及SP-B mRNA水平和RAC均差异无统计学意义(P>0.05)；生后7 d，与对照组比较，实验组RAC开始减少(6.35±0.83 vs. 7.67±0.52)，HoxB5(0.98±0.14 vs. 1.20±0.16)及AQP-5(0.78±0.11 vs.1.04±0.19)mRNA也明显降低(P<0.05)、SP-B(1.34±0.04 vs.1.04±0.11)反而明显升高(P<0.05)；生后14 d，实验组RAC逐渐减少，HoxB5及AQP-5 mRNA持续下降，21 d，HoxB5(0.64±0.11 vs. 1.18±0.13)及AQP-5(0.67±0.12 vs. 0.97±0.01) mRNA降至最低(P<0.01)，而SP-B (1.43±0.07 vs. 1.12±0.09)mRNA升至最高(P<0.01)；实验组肺组织HoxB5 mRNA水平及RAC呈明显正相关(γ＝0.685，P<0.01)。 结论 暴露高氧中早产鼠的肺组织HoxB5基因呈低水平表达，其表达降低可能导致的Ⅱ型肺泡上皮细胞向Ⅰ型肺泡上皮细胞的分化障碍与CLD肺发育停滞密切相关。

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)及神经干细胞(NSCs)联合移植对缺氧缺血性脑损伤( HIBD)的治疗效果。 方法 取新生24 h的Wistar大鼠海马NSCs进行培养、鉴定。选7日龄Wistar大鼠制备HIBD动物模型，模型制备后7 d行损伤侧侧脑室移植。将实验大鼠随机分为6组：正常组、模型组、假移植组、NSCs移植组、BDNF组、BDNF＋NSCs移植组(联合移植组)。移植后4周进行功能实验，取脑组织进行免疫组化免疫荧光检测。 结果 从新生大鼠海马可成功培养出NSCs。Y迷宫实验结果：NSCs移植组达到学会的次数及正确记忆次数(163 ±11.60，5.00±1.13)n；BDNF组(150.00±8.94, 5.17±1.47)n；BDNF＋NSCs移植组(111.25±13.56, 6.23±1.60)n。悬吊实验结果：NSCs移植组平均(30.10±11.8)s；BDNF组(36.25±10.98)s；BDNF＋NSCs移植组(43.6±10.56)s 。斜坡试验结果：NSCs移植组(20.3±8.25)s ；BDNF组(14.33±2.88)s ；BDNF＋NSCs移植组(11.17±2.48)s 。表明联合移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与NSCs移植组比较明显改善(P<0.05)，而NSCs移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与HIBD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。联合移植组损伤侧额叶皮层、海马存活的NSCs数量(9.31±0.71个，10.10±1.65个)与NSCs移植组(3.33±0.24个，4.22±0.33个)比较差异具有统计学意义(P<0.01)，且NSCs分化为神经元的比例明显增多，与NSCs移植组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 BDNF与NSCs联合移植较单独NSCs移植对HIBD有更好的疗效。