2006年 · 第44卷第07期

目的 分析电压门控钾离子通道基因KCNQ2与1个良性家族性婴儿惊厥(benign familial infantile convulsions，BFIC)家系的关系，探讨BFIC的分子遗传机制。 方法 1个中国陕西地区4代BFIC家系，采集41名家系成员及家系外75名健康对照的血样，采用PCR扩增、DNA直接测序技术进行KCNQ2基因突变分析，采用多聚酶链反应－单链构象多态性进行基因型和表型共分离研究。 结果 PCR－DNA直接测序在先证者第5号外显子发现KCNQ2基因杂合突变G812T，导致KCNQ2蛋白孔区一个甘氨酸被缬氨酸替代(G271 V)，这个位置的甘氨酸在KCNQ家族进化上高度保守。此突变与以前发现的良性家族性新生儿惊厥( benign familial neonatal convulsion，BFNC)家系KCNQ3突变(G310V)是同一位置相同的氨基酸改变。家系中其他患儿均检出与先证者相同的突变，而家系内参加本研究的健康人和家系外75名健康对照未出现这种突变。 结论 KCNQ2基因突变可能是部分BFIC的分子发病机制，KCNQ2基因G812T突变是国内外未曾报道过的新突变，进一步开展G812T突变的功能研究有助于理解BFIC及其他原发性癫FDA1的分子发病机理。

目的 探讨多巴反应性肌张力障碍(DRD)临床及GTP环化水解酶Ⅰ(GCHⅠ)基因突变特点。 方法 对14例DRD患儿的临床资料进行总结分析，并对其中6例进行了GCHⅠ基因全长外显子的突变检测。 结果 14例患儿平均发病年龄为(10±3)岁，女性起病较男性早，发病年龄(9±4)岁，男性发病年龄(12±1)岁。常见的首发症状为步态异常、下肢僵硬和震颤。伴晨轻暮重者9例(64%)。小剂量多巴制剂治疗3个月后痊愈13例(93%)，显效1例(7%)，长期随访未发现多巴制剂的不良反应。对6例患儿进行GCHⅠ基因突变检测，在3例患儿中发现了2种GCHⅠ基因突变。其中一家系2例患儿存在第6号外显子的Lys224Arg杂合错义突变，临床表型较轻，与国外研究报道一致。在1例散发病例中发现了国际上未曾报道过的位于第3号外显子的Gln161Pro突变，临床表型较重。 结论 DRD临床表现复杂多样，晨轻暮重是其特点之一。多巴制剂对其有快速、显著和持续的疗效。GCHⅠ基因突变类型与临床表型之间有一定关联，对GCHⅠ基因突变的检测有助于不典型病例的早期诊断。

目的 报告在2例婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病中发现棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)基因2个新的突变。 方法 先证者1和2均在1岁以内出现进行性智能和运动发育倒退。病理检查诊断为婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病。对先证者1和2以及前者的父母的PPT1基因编码区9个外显子及两旁的内含子序列设计引物进行PCR扩增，扩增产物测序检查。 结果 先证者1存在复合杂合突变，分别为第6外显子的c550G→A即E184K点突变和第1内含子的IVS1＋1G→A剪接突变。其父亲在第1内含子也存在IVS1＋1G→A杂合性剪接突变，其母存在E184K杂合性突变。先证者2存在纯合突变，在第3外显子出现c272A→C即Q91P突变。对50例正常人DNA进行突变筛查均未发现相同突变。 结论 PPT1基因在第1内含子的IVS1＋1G→A剪接突变以及第3外显子的Q91P突变为2个以前没有报道的新突变，导致婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病的发生。因此中国人的婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积病在PPT1基因的突变类型方面和其他地区的病例可能不完全相同。

目的 探讨不同胎龄人胎脑室下区神经干细胞(NSCs)的生长特征。 方法 收集胎龄16～36周的胎儿90例，每例研究对象取室下区脑组织作为实验材料。所有研究对象产前经B超诊断患有先天性心脏病或消化道畸形，均无脑发育异常，孕妇及其丈夫要求终止妊娠。采用免疫组化技术对人胎脑室下区NSCs的形态、存在方式以及数量进行检测，采用细胞培养技术对其进行培养、传代、分化观察，并应用免疫组化技术对培养及分化的细胞进行鉴定。 结果 人胎脑室下区NSCs具有星形、圆形、椭圆形及梭形等形态，以星形最多。细胞胞浆相对较少；核呈圆形，染色质疏松，1～4个核仁不等。可见NSCs对称分裂和不对称分裂现象，NSCs多数单个散在分布，有的NSCs与别的NSCs形成突触联系。不同胎龄人胎脑室下区NSCs随着胎龄的增加而减少(χ2＝4644.602，P<0.01)。不同胎龄以及同一胎龄不同个体的NSCs在上述方面存在一定的差别。从人胎脑室下区分离的细胞在无血清培养时呈悬浮状态生长，形成神经球。该细胞可传代培养，表达神经巢蛋白抗原(Nestin)；而在含血清培养时能分化，分化细胞表达神经元细胞、少突及星形胶质细胞的特异性抗原。 结论 不同胎龄人胎脑室下区均存在NSCs，且在形态、存在方式及数量上存在一定的差异。不同胎龄人胎脑室下区均能在体外培养出NSCs。

目的 探讨小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化的影响及其机制。 方法 体外分离、培养BABL/c胎鼠NSCs，利用NSCs向神经细胞分化模型，用感染复数(MOI)为1的含LacZ报告基因的重组MCMV毒株RM461进行感染，通过免疫组化、流式细胞术和RT－PCR检测MCMV感染后Nestin、GFAP和NSE阳性细胞比率及对神经干细胞分化相关信号分子Wnt－1和neurogenin 1(Ngn1)基因表达的影响。 结果 体外分离培养的NSCs，神经干细胞特异性标志Nestin表达强阳性，并可进一步分化为GFAP阳性的星形胶质细胞和NF－200、NSE阳性的神经元。当NSCs分化培养2 d，感染组和未感染组Nestin阳性细胞分别为(62.2 ±1.8)%和(37.2±2.4)%(t＝4.62，P<0.01)，差异有统计学意义；而GFAP阳性细胞的比例分别为(37.4 ±1.6)%和(50.3 ±1.8)%(t＝9.89，P<0.01)，NSE阳性细胞的比例分别为(8.9±0.8)%和(23.4±1.3)% (t＝5.09，P<0.01)，差异均有统计学意义。感染组和未感染组Wnt－1基因的相对表达量分别为0.14±0.03和0.32 ± 0.04 (t＝7.21，P<0.01)，Ngn1基因的相对表达量分别为0.09±0.01和0.21±0.02(t＝10.73，P<0.01)，差异均有统计学意义。 结论 (1) CMV可抑制NSCs分化，这可能是CMV致脑发育异常的重要机制；(2) CMV感染可抑制Wnt－1和Ngn－1的基因表达而影响NSCs分化，人为调控这两条通路可能为探寻防治CMV感染致脑发育异常的方法提供新策略。

目的 探讨影响人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)成功培养的相关因素，以期提高其培养成功率。 方法 脐血依胎龄分为3组：40周胎龄组(n＝11)；36周胎龄组(n＝6)；32周及其以下胎龄组(n＝5)。采用相对适宜的条件培养，观察能成功培养出MSCs的比率，探讨脐血MSCs培养与胎龄、脐血单个核细胞数量(mononuclear cells, MNCs)、脐血容量之间的相关关系，以及各因素之间可能存在的相关关系。通过检测脐血MSCs的生长曲线、细胞群体倍增时间、成纤维细胞集落形成数目(fibroblast colony forming unit, CFU－F)、表面标志的表达来观察脐血MSCs细胞的生物学特性。 结果 脐血MSCs培养成功率达54.5%。MSCs培养成功与否与接种于培养瓶内脐血MNCs数量密切相关，脐血MNCs接种数量在1.25×108/L以上者培养成功率达83.3%。单位体积内脐血MNCs含量与胎龄呈负相关。小胎龄者脐血MSCs成集落能力(CFU－F数目)高于大胎龄。流式细胞术检测显示，在原代培养细胞增殖期末间充质干细胞的重要表面标志CD29有62.1%的表达，传1代细胞表达CD29、CD105分别为78.3%和85.0%；造血系统的表面标志CD34、CD45则始终在3.0%以下。 结论 脐血MNCs的接种数量在1.25×108/L以上可以提高培养的成功率。相同容量内脐血MNCs与胎龄呈负相关，且脐血MSCs样细胞集落形成能力(CFU－F计数)小胎龄者高于大胎龄，可能是小胎龄脐血MSCs相对容易培养成功的原因之一。

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)的特性及向神经细胞分化的可能性，为神经移植寻找新的细胞来源。 方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记；丹参和β巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化，用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定；半定量逆转录聚合酶链反应(RT－PCR)检测细胞的神经相关基因表达。 结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞，体外生长形态类似于成纤维细胞，可以维持在未分化状态稳定增殖，体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105呈现高表达，造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD28、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80(B7－1)、CD86(B7－2)、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化，分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白(Nestin)，神经元的标记β－Ⅲ类神经微管(β－TubulinⅢ)和神经微丝(NF)，以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。RT－PCR检测证实，经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin，诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin，诱导后的表达明显增强。 结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs，易于培养扩增，其表达MSCs的表面标记，不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞，表达神经细胞的相关标记和基因，这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。

目的 通过连续的监测，了解北京地区婴幼儿甲型流感的流行规律。 方法 2001年10月—2005年8月，采集门诊和住院急性呼吸道感染患儿的标本7338份，分别经传代狗肾细胞进行病毒分离和(或)间接免疫荧光、血凝抑制试验进行流感病毒型别鉴定，采用RT－PCR方法，扩增甲3型流感病毒流行株的血凝素基因HA1区，进行序列分析。 结果 (1)从7338份临床标本中，检出甲型流感病毒347份，总阳性率为4.7%。347份甲型流感病毒中，甲1型48份(13.8%)；甲3型273份(78.7%)；暂时无法鉴定亚型的26份(7.5%)。(2) 2001—2004年的流行比较局限在当年10月至次年4月，2004年8月—2005年8月均有甲型流感病毒被检测到，在夏季仍可检测到相当多的甲型病毒，尤其是2005年8月甲3型的阳性率达到14.2%，相当于2003—2004年的流行最高峰。4年中每个流行季节都以甲3型流感病毒的流行为主，只在2001—2002年和2004—2005年的流行季节出现了甲1型流感病毒的流行峰。(3)甲1和甲3型流感病毒在门诊患儿中的阳性检出率均高于住院患儿的阳性检出率。在2003年11月—2005年8月期间的236例甲3型感染患儿中，≤2岁者占46.6%，>5岁者占14.0%；而31例甲1型感染患儿中≤2岁者只占6.5%，>5岁者占48.0%。(4)对1998—2005年的甲3型流感病毒血凝素基因HA1区的序列分析显示，每一年的甲3型病毒都会出现位于其抗原决定簇关键位点的氨基酸突变。 结论 2001年10月—2005年8月，北京地区婴幼儿中有甲1和甲3型流感不同程度的流行，甲3型为优势流行株；2004—2005年北京地区甲型流感呈全年的流行态势；氨基酸序列分析提示，1998—2005年期间甲3型流感病毒的抗原性在持续不断地发生漂移。

目的 了解Galectin－7在哮喘患儿支气管上皮细胞凋亡中的作用。 方法 经纤维支气管镜获得哮喘与非哮喘对照儿童的支气管黏膜，采用组织块培养方法进行支气管上皮细胞的培养，将RSV感染支气管上皮细胞，应用Micro array分析哮喘与非哮喘对照儿童支气管上皮细胞在RSV感染后表达有差异的基因；经GeneBank查询确定，这些差异基因中与凋亡有关的基因为Galectin－7。随后选取10例哮喘儿童和17例非哮喘对照儿童的支气管黏膜，应用原位末端标记法(TUNEL法)、原位杂交和免疫组化方法，分别对支气管上皮细胞凋亡、上皮细胞中Galectin－7及其mRNA表达进行观察。 结果 哮喘儿童支气管上皮细胞在RSV感染后Galectin－7基因上调8倍，哮喘儿童较非哮喘对照儿童支气管上皮细胞中Galectin－7以及mRNA表达增加，凋亡也同时增加。 结论 Galectin－7可能与哮喘患儿支气管上皮细胞的凋亡有关。Galectin－7可能通过这一作用，参与哮喘发病。

目的 探讨高热惊厥(febrile seizures，FS)对发育期大鼠脑内γ氨基丁酸B受体(γ－aminobutyric acid B receptor，GABABR)亚基GABABR1与GABABR2表达及结合改变的远期影响。 方法 采用热水浴诱导大鼠反复惊厥。隔日诱导惊厥1次，共诱导10次。发育期大鼠随机分为正常对照组(n＝64)和高热处理组(n＝268)。正常对照组大鼠置于37℃水中，高热处理组大鼠置于44.8℃热水中。高热处理组大鼠按其是否出现惊厥又分为高热对照组(H，n＝64)和高热惊厥组。隔日诱导惊厥1次，共10次。惊厥组大鼠取惊厥1次(FS1，n＝64)和10次(FS10，n＝64)者作为实验对象。采用免疫双标记检测GABABR1与GABABR2共位点表达的改变；采用竞争RT－PCR检测GABABR1与GABABR2定量表达的改变；采用免疫共沉淀/Western Blot检测GABABR1与GABABR2结合的改变。 结果 (1)10次高热处理后，大鼠海马GABABR1和GABABR2的表达明显降低。(2)H组和FS1组大鼠GABABR1和GABABR2表达量及二者结合量在末次处理后7～15 d恢复正常，而FS10组未恢复正常。(3)FS10组在末次处理后30 d GABABR1表达恢复正常，而GABABR2及二者结合量未恢复正常。 结论 发育期大鼠反复高热惊厥可导致GABABR亚单位GABABR1与GABABR2表达及二者结合量的远期改变。

目的 平滑肌细胞表型具有可塑性，在哮喘气道重建中，平滑肌细胞表型由收缩型向合成型转化。本研究探讨气道平滑肌细胞在转化生长因子－β1(TGF－β1)刺激下细胞表型转换的特异性标志物基质Gla蛋白(MGP) mRNA和主要纤维化蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的表达。 方法 人气道平滑肌细胞体外原代培养，传2～3代后重新接种，实验组10组，给予TGF－β1 100 μg/ml刺激，每组均设未予TGF－β1复管作为对照，其余培养条件相同，7 d后90%的细胞融合，收获。RT－PCR方法研究平滑肌细胞MPG mRNA的表达，Western blot法分析胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的表达水平。 结果 经TGF－β1刺激后，气道平滑肌细胞表达MGP mRNA为(62.3±13.1)%，对照组MGP mRNA为(27.4±11.4)%，两组差异有统计学意义(P<0.01)，TGF－β1刺激后的平滑肌细胞表达胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ分别为(灰度值)67.6±10.0，94.5±9.8，83.8±16.2，高于对照组的平滑肌细胞，差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 TGF－β1促进气道平滑肌细胞表达MGP mRNA和胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ，后两者作为气道平滑肌细胞表型转化的早期标志物，表明平滑肌细胞存在由收缩型向合成型转化的趋势。可以认为TGF－β1与平滑肌细胞的相互作用促进了气道重建过程。

目的 研究酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor，TrkB)及其配体脑源性神经营养因子(brain－derived neurotrophic factor，BDNF)的表达水平对神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)细胞化疗敏感性的影响。 方法 Western－blot技术检测不同纳摩尔浓度全反式维甲酸(all trans－retinoic acid, ATRA)诱导后TrkB蛋白水平变化；四甲基偶氮蓝比色( MTT )法检测细胞存活率；流式细胞仪(flow cytometer，FCM)检测细胞凋亡率；透射电镜检测凋亡细胞的形态。 结果 (1)不同浓度ATRA(1、10、100 nmol/L)处理神经母细胞瘤细胞SY5Y 5 d，TrkB蛋白水平随ATRA浓度增加而增加；(2) BDNF 10 ng/ml＋ATRA 10 nmol/L＋顺铂(Cisplatin, CP) 5 μg/ml作用组细胞存活率、凋亡率同单用CP组比较均无显著差异，BDNF(50、100 ng/ml)加相同浓度ATRA及CP组细胞存活率均明显高于单用CP组，凋亡率均明显低于单用CP组，BDNF 100 ng/ml组存活率高于BDNF 50 ng/ml组，凋亡率低于BDNF 50 ng/ml组。ATRA 1 nmol/L＋BDNF 50 ng/ml＋CP5 μg/ml组细胞存活率、凋亡率同单用CP组比较无显著差异，ATRA 10、100 nmol/L加相同浓度BDNF及CP组细胞存活率均明显高于单用CP组，凋亡率均明显低于单用CP组，ATRA 100 nmol/L组细胞存活率高于ATRA 10 nmol/L组，凋亡率低于ATRA 10 nmol/L组。(3)透射电镜技术观察到CP作用组可见到较多细胞呈凋亡改变，而ATRA 10 nmol/L＋BDNF 50 ng/ml＋CP 5 μg/ml组细胞形态多数正常。 结论 SY5Y对化疗药顺铂的敏感性受TrkB及BDNF水平的影响，二者水平越高越容易产生化疗耐药。