2024年 · 第47卷第04期

目的 应用高通量二维PCR技术（2D-PCR），建立一种单管一步法检测和鉴定宫颈细胞中16种高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）亚型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82）、p53（rs1042522）和RB1（rs3092905）基因型的方法。 方法 根据16种不同亚型HR-HPV、p53及RB1基因DNA序列设计特异性引物，同时将待测靶基因p53及RB1基因作为评判标本取样及PCR扩增成功与否的内参基因。在3个荧光检测通道中，采用相应标签标记不同亚型HR-HPV、p53及RB1的上游引物，并构建完善的2D-PCR检测体系。应用该方法检测804份来源于常州市第一人民医院2022年12月至2023年8月妇科门诊的宫颈刷样本，将检测结果与PCR-反向点杂交法、流式荧光杂交法、单重实时荧光定量PCR法分别进行一致性比较；同时采用Sanger测序法检测p53和RB1的基因型。采用Kappa检验评价2D-PCR法和其他方法间的一致性。 结果 2D-PCR可通过FAM、HEX和Alexa Fluor568通道的特征性熔解谷对16种HR-HPV型别和p53、RB1的基因型进行准确区分和鉴定。2D-PCR法与PCR-反向点杂交法具有较高的一致性（Kappa=0.699），与流式荧光杂交法具有更高的一致性（Kappa=0.793），和单重荧光定量PCR法的一致性Kappa=0.880（95%CI 0.862~0.907）。以Sanger测序法为金标准，2D-PCR法检测p53、RB1基因型的准确度为100%。p53 rs1042522 位点3种基因型（G/G型、G/C型和C/C型）的分布频率为32.09%（258/804）、49.88%（401/804）和18.03%（145/804），RB1 rs3092905位点检出基因型均为A/A型。 结论 成功开发了一种2D-PCR方法，用于高危型HR-HPV型别鉴定与宫颈癌相关肿瘤抑制基因p53和RB1的基因分型。

肿瘤靶基因甲基化检测技术在癌症早期筛查、治疗药物选择、疗效监测、预后预测等方面具有良好的应用前景和发展空间。大量研究表明，检测单个癌症靶基因甲基化水平在肿瘤早期诊断和治疗策略选择中具有巨大潜力。以肺癌、肝癌、鼻咽癌、妇科生殖道肿瘤的子宫颈癌与子宫内膜癌等DNA甲基化检测为切入点，可从癌靶基因筛选、基因甲基化的生物学和临床意义探索DNA甲基化临床转化可行性与价值。未来开展更多前瞻性大样本量临床研究，有望将其转化为临床诊断和治疗的重要生物标志物。

肿瘤的发生发展过程中常伴随着表观遗传学改变，DNA甲基化是最常见的表观遗传学修饰方式。甲基化事件与妇科肿瘤的早期发生密切相关，基于液体活检技术的甲基化检测方案在妇科肿瘤早筛和预后评估中取得重要进展，多种来源的微创和无创样本中甲基化检测呈现出类似或优于传统方案和策略的可靠性。本文对甲基化检测在妇科肿瘤筛查、诊断和监测的相关进展作一综述，探讨其当下和未来在妇科肿瘤诊治中的价值和研究方向。

恶性肿瘤已成为影响人类健康的主要原因，绝大多数尚缺乏高敏感度和特异度的诊断指标和治疗靶点。RNA甲基化修饰是近年来前沿研究热点，肿瘤组织、细胞和患者外周血中RNA甲基化修饰谱和修饰水平变化与肿瘤发生、发展、预后密切相关，具备作为肿瘤精准诊断和治疗的靶标潜能。尽管目前RNA甲基化修饰检测方法学、作用机制研究和基于RNA甲基化修饰治疗药物的研发仍面临诸多挑战，但其作为肿瘤液体活检指标研究的新方向，展现出良好的临床价值和转化潜能，可为肿瘤的精准诊断、治疗靶标和药物研发提供新的策略和方向。

肺癌是癌症死亡的主要类型，大多数肺癌患者在诊断时就已为晚期，预后相当差。虽然低剂量计算机断层扫描已经进入临床作为肺癌筛查的工具，但是其假阳性率超过90%。作为研究热点的表观修饰之一，DNA甲基化在包括癌症在内的多种疾病中起着关键作用。抑癌基因的高甲基化和原癌基因的低甲基化是肿瘤发生发展中的重要事件。因此，DNA甲基化分析可以为肺癌的早筛、诊断、治疗和预后中提供一些有用的信息。尽管组织活检等侵入性方法仍然是肿瘤诊断和监测的金标准，但也存在取样不便等局限性。近年来，液体活检发展迅速，它可以检测原发性或转移性恶性肿瘤，并能反映肿瘤的异质性。此外，它可以微创或无创的形式进行样本收集，年老体弱患者也具有良好的耐受性。本文探讨了一些用于DNA甲基化分析的新兴技术并概述了DNA甲基化在肺癌诊疗中的应用。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在人体血清（浆）类固醇激素检测中展现出优于传统免疫学方法的特异性高、分析测量范围宽、多标志物同时检测等特点，已成为国际内分泌学领域相关疾病实验室诊断的首选方法。目前，国内医学实验室开展血清（浆）类固醇激素LC-MS/MS检测多参考已发表学术论文和仪器厂家说明书提供的通用操作和检测程序。然而，血清（浆）类固醇激素LC-MS/MS检测的技术难度大，临床实验室检验人员大多数缺少质谱领域专业培训和实践经验，而通用程序缺乏针对性和实操性，尤其我国尚无针对该检测程序和质量保证的系统性文件，导致实验室间检测结果存在较大差异，阻碍了该技术的临床应用。为规范我国血清（浆）类固醇激素LC-MS/MS检测，共识从检验前、中、后程序及其质量保证进行详细说明，并提出针对性建议，为实验室开展该检测项目提供参考，以推动我国血清（浆）类固醇激素LC-MS/MS检测的临床应用和结果一致性。

目的 探讨应用血液游离DNA（cfDNA）甲基化［半胱氨酸双加氧酶1型（CDO 1）基因和同源盒蛋白A9（HOXA9）基因］检测卵巢癌的临床应用及分层管理价值。 方法 收集2022年1月至2023年10月就诊于成都市妇女儿童中心医院妇科有卵巢肿块手术指征患者作为研究对象进行病例对照研究。术前采集血液进行血癌抗原125（CA125）、人附睾蛋白4（HE4）、卵巢恶性肿瘤风险算法（ROMA）指数评估及DNA甲基化检测。同时收集患者基本临床信息、生物标记物与经阴道超声（TVS）等信息。共收集151例研究对象，其中病理检查良性122例，卵巢癌29例。以腹腔镜下卵巢组织病理学诊断为金标准，采用多因素Logistic回归分析卵巢癌的高危因素，利用受试者工作特征曲线下面积（AUC）分析DNA甲基化检测对卵巢癌的临床检测效能。 结果 卵巢癌患者组的年龄、绝经状态、CA125与HE4检测、ROMA指数、CDO1基因与HOXA9基因单独或联合检测的阳性率均高于良性组（P<0.05）。CDO1与HOXA9双基因甲基化联合诊断卵巢癌的AUC最高为0.936（95%CI 0.878～0.994），其敏感度、特异度分别为89.7%（95%CI 73.6%～96.4%）和97.5%（95%CI 93.0%～99.2%）。早期卵巢癌国际妇产科联盟分期I、Ⅱ中CDO1与HOXA9双基因甲基化阳性检出率为12/14。 结论 在卵巢癌的风险评估和早期检测中，cfDNA的甲基化分析显示出了较高的准确性和检测效能。

目的 探讨宫颈癌组织铜死亡相关基因的甲基化水平差异及对临床预后的影响。 方法 从公共数据库中获取310份宫颈组织标本的甲基化数据，通过UALCAN数据库对12个铜死亡相关基因进行甲基化水平差异分析，研究其在宫颈癌不同分期和分级中的差异，从中筛选差异有统计学意义的基因，并通过EWAS datahub数据库进行预后分析。最后，对筛选出的基因进行基因富集分析、通路分析、免疫浸润分析，并使用cBioportal数据库分析该基因在宫颈癌中的突变率和肿瘤突变负荷（TMB）。对甲基化水平和免疫细胞浸润差异采用两独立样本秩和检验；采用KM生存曲线和Log-rank双侧检验对总生存期进行比较分析；在TMB分析中使用Wilcoxon Test进行统计学分析；在GSEA和通路分析中使用皮尔逊相关分析。 结果 患者宫颈癌组织中的细胞周期依赖激酶抑制基因2A（CDKN2A基因）甲基化β值为0.075，高于正常人组织中的甲基化β值0.049（P=0.008），患者宫颈癌组织中的二氢脂酰胺S-乙酰基转移酶（DLAT基因）甲基化β值为0.102，高于正常人组织中的甲基化β值0.080（P=0.002），患者宫颈癌组织中的脂酰转移酶1（LIPT1基因）甲基化β值为0.060，低于正常人组织中的甲基化β值0.092（P=0.009）。CDKN2A基因甲基化水平≥0.199的患者的总生存期为14.75年，低于甲基化水平<0.199患者（17.56年）（P=0.034）。基因富集分析结果提示主要涉及Ⅰ型干扰素的反应、DNA复制等生物过程；CDKN2A基因表达与肿瘤微环境中中性粒细胞和树突状细胞的数量呈正相关（P<0.05），与巨噬细胞的数量呈负相关（P<0.05）。CDKN2A基因变异组的TMB高于未变异组（P=0.019）。 结论 CDKN2A基因甲基化是宫颈癌预后的潜在生物标志物。

目的 探究联合检测血浆中游离BMPR1A、PLAC8基因甲基化预测肝细胞癌术后复发的作用。 方法 病例系列研究。选取2022年1月至2023年7月中山大学附属第三医院治疗的Ⅰ~Ⅳ期肝细胞癌患者，入组的所有患者在治疗后1、3、6、9和12个月进行甲胎蛋白（AFP）以及影像学评估检查；同时抽取患者外周血进行血浆循环肿瘤DNA（ctDNA）甲基化检测，比较患者治疗后血浆中游离BMPR1A和PLAC8基因甲基化检测结果以及传统肿瘤标志物AFP检测的阳性率。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析该方法对肝细胞癌复发的预测效能，并根据游离DNA甲基化结果阳性和阴性，以及AFP是否大于7 μg/L，分别将肝细胞癌患者划分为甲基化高风险组（12例）、甲基化低风险组（21例）、AFP高风险组（15例）和AFP低风险组（18例），进行Kaplan-Meier生存分析。 结果 联合检测血浆中游离BMPR1A、PLAC8基因甲基化对肝癌复发预测的敏感度为66.7%，特异度为88.9%，ROC曲线分析BMPR1A、PLAC8基因甲基化检测肝癌复发的曲线下面积为0.770和0.778，AFP为0.522；相比影像学检查，游离DNA甲基化检测平均可以提前58.3 d检测出肝细胞癌的复发（53.8 d比112.1d）。基于游离DNA甲基化预测的高风险组400 d的无进展生存率为22.2%，低于低风险组（76.2%，P<0.001）。 结论 相比于AFP，检测BMPR1A、PLAC8基因甲基化能更准确地预测肝细胞癌的复发，可成为一种实用的监测肝癌复发的方法。

目的 探讨女性自采样本进行配对盒基因1（PAX1）/结合连接黏附分子 3（JAM3）双基因甲基化检测在子宫颈癌筛查与绝经前后女性分层管理的应用价值。 方法 单中心横断面研究。2023年1—11月在阴道镜门诊同时收集女性自采样本及医生采样样本，分别进行PAX1/JAM3双基因甲基化（PAX1m/JAM3m）检测，以组织病理学为标准。总计招募301例接受阴道镜检查女性，并对272例有组织病理与检测信息的女性进行统计分析。通过Spearman相关性分析和χ²检验比较两种采样方法PAX1m/JAM3m检测结果的一致性。通过计算受试者操作特征曲线（ROC）和曲线下面积（AUC）比较女性自采样本甲基化检测与现行临床检测及其组合方法在临床研究中用于子宫颈癌筛查的效益。 结果 在所有招募的受试者中，正常子宫颈组织或慢性子宫颈炎102例（37.5%）、子宫颈上皮内瘤变1级（CIN1）72例（26.4%）、CIN2 43例（15.8%）、CIN3 29例（10.7%）、子宫颈癌26例（9.6%）。按最低检出量公式计算区分成为81例一致性研究组和191例临床研究组。Spearman相关性分析表明，自采样本和医生采样样本进行PAX1和JAM3双基因甲基化检测结果的卡氏评分呈正相关（r=0.858、0.828，P均<0.001）；自采样本在临床研究中结果显示PAX1m/JAM3m检测诊断CIN2或更严重病变（CIN2+）的敏感度和特异度分别为77.6%（95%CI 65.3%~86.4%）和87.2%（95%CI 80.5%~91.9%），PAX1m/JAM3m联合人乳头瘤病毒16/18型（HPV16/18）检测的敏感度与高危人乳头瘤病毒（hrHPV）检测相同为89.7%（95%CI 79.2%~95.2%）；在CIN3+时为96.0%（95%CI 80.4%~99.3%），优于hrHPV的92.0%（95%CI 75.0%~97.8%）、细胞学的82.6%（95%CI 62.9%~93.0%）及sPAX1m/JAM3m 联合细胞学检测低度及以上鳞状上皮内病变（LBCLSIL+）［87.0%（95%CI 67.9%~95.5%）］。 结论 女性自采样本进行PAX1与JAM3双基因甲基化检测作为子宫颈癌筛查具有操作与临床可行性。

目的 分析直接稀释法的酸性或碱性稀释剂对电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测量全血多种元素结果的影响，探讨2种稀释剂是否在元素测定结果上存在相互替代的可能性。 方法 采用国家人体生物监测项目2018年8月份收集到的162份人全血样本，使用不同的稀释剂将全血样本进行稀释后离心，使用ICP-MS测定样本上清液。分别对使用酸性稀释剂（0.1%硝酸+0.01%曲拉通溶液）和碱性稀释剂（0.05%正丁醇+0.01%曲拉通+5%氢氧化铵溶液）的2种前处理方法进行方法学特性评估，使用Spearman相关系数分析2种稀释剂测定的全血中19种元素结果的相关性，通过Passing-Bablok线性回归和Bland-Altman图评估162个全血样本中19种元素使用2种稀释剂的测定结果的一致性。 结果 使用2种稀释剂的19种元素方法学技术指标数据良好，19种元素使用酸性稀释剂定量限范围为0.1~15.8 μg/L；碱性稀释剂定量限范围为0.3~19.2 μg/L，19种元素酸、碱稀释剂标准曲线的线性相关系数均≥0.995，除锶、镉、锡、铊外的元素回收率范围均在80%~120%，所有元素在酸性、碱性稀释剂的批内、批间的总变异系数范围为0.5%~12.4%。2种稀释剂对铬、锰、钴、锌、铜、砷、硒、锶、钼、银、镉、锑、钡、汞、铅测定值的相关性较强（R2均>0.8），钒、镍、锡、铊相关性较弱（R2均<0.8）。钒、镉、锡、钡、汞的斜率95%置信区间<1。铬、镍、砷、银、钡、汞，截距95%置信区间包含0点。Bland-Altman图显示，钒、铬、砷、锶、银、镉、锡、汞使用酸性和碱性稀释剂的一致性较好。 结论 不同元素之间使用2种稀释剂测定的均值结果存在差异，无法完全替代。

目的 构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。 方法 首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。 结果 构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（P<0.001）、一步生长曲线（P=0.001）、感染复数（P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论 成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的 探索不同部位结直肠癌肠道菌群的差异以及特征菌联合肿瘤标志物在近端结肠癌中的鉴别效能。 方法 病例对照研究。选取2019年5月至2022年7月在安阳市肿瘤医院普外科确诊的结直肠癌（CRC）85例和结直肠腺瘤（CRA）患者8例，根据原发部位CRC又分为近端结肠癌组（PC）22例、远端结肠癌组（DC）15例和直肠癌组（RC）48例。肠道准备前采集患者血液和粪便样本分别进行肿瘤标志物检测和16S rDNA基因测序。采用SPSS（27.0.1）软件进行单因素方差分析、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验或χ2检验比较组间差异，并利用SPSS对肿瘤标志物、特征菌分别进行单独和联合绘制鉴别PC的受试者工作特征（ROC）曲线。 结果 PC组、DC组、RC组和CRA组进行组间比较，糖类抗原125（CA125）、CA72-4以及血清肿瘤相关物质（TAM）差异有统计学意义（F=3.543，P<0.05；F=3.596，P<0.05；F=5.787，P<0.01）。其中PC组的CA125水平和CA72-4水平高于RC组［PC组比RC组，（36.84±6.30）kU/L比（12.73±4.21）kU/L，P<0.01；PC组比RC组，（45.56±10.86）kU/L比（3.30±7.63）kU/L，P<0.01］，PC组的TAM水平高于RC组和CRA组［PC组比RC组，（124.84±5.19）U/ml比（102.44±3.63）U/ml，P<0.001；PC组比CRA组，（124.84±5.19）U/ml比（95.39±8.42）U/ml，P<0.01］。LEfSe分析显示PC组的特征菌包括拟杆菌科、奈瑟菌科、梭菌科和螺旋体科等。TAM联合拟杆菌科鉴别诊断PC的曲线下面积最大，为0.845（95%CI 0.747~0.944），敏感度为0.857，特异度为0.815。 结论 不同部位CRC以及CRA间的肠道菌群组成具有异质性，肠道菌群联合肿瘤标志物在区分近端结肠癌中具有良好的鉴别效能。

患者女，11岁，因患重度β型地中海贫血于2022年7月27日在深圳市儿童医院接受细胞与基因治疗（CGT）。出院后2次随访检测均发现患者的HIV-1病毒抗原及抗体筛查实验（化学发光法）结果呈阳性，2次HIV-1核酸定量试验病毒载量结果均>5 000拷贝/ml，按照《全国艾滋病检测技术规范（2020年修订版）》可判定为HIV/AIDS感染。但经深入调查与比对实验发现：该患者HIV-1核酸检测结果异常，系其CGT治疗过程中自体造血干祖细胞基因组整合的慢病毒载体片段与现用HIV-1核酸检测试剂盒检测靶位点存在交叉反应所致，提示在对接受过CGT的人群进行HIV-1核酸检测时，需根据其所用基因工程载体选择合适的、不会引起交叉反应的检测平台。同时建议设计开发专门用于HIV核酸补充试验的采用多靶点不同荧光标记的检测平台，以降低艾滋病病毒感染的假阳性诊断风险。

鼻咽癌是一种常见于中国南方的恶性肿瘤，其发生、发展机制仍未完全明确。但已有大量研究表明 DNA甲基化在鼻咽癌的筛查、诊断、治疗及预后评估中具有重要临床应用价值。DNA甲基化通过调控肿瘤发生与发展关联基因的转录、蛋白质表达等方式影响鼻咽癌细胞的分裂周期、生长、侵袭和迁移。此外，鼻咽癌在不同发展阶段的DNA甲基化表达水平存在显著差异，这为鼻咽癌的早诊早治与治疗评估提供了理论指导和临床参考。当前研究表明DNA甲基化检测或可提供一种既简便又高效的鼻咽癌早期筛查手段，同时也可以为无创性筛查方法的发展提供新思路。

产酸克雷伯菌是一种重要条件致病菌，可引起成人、儿童、社区或医院获得性感染。其中，产酸克雷伯菌最常引起的疾病是抗生素相关出血性结肠炎（AAHC）。此外，它还可引起尿路感染、肺部感染、血流感染等疾病。目前，关于产酸克雷伯菌致病相关的机制研究较少，其中较为明确的有产细胞毒素Tilivalline和Tilimycin，作为产酸克雷伯菌重要的毒力因子，可导致AAHC的发生。考虑到国内关于产酸克雷伯菌的研究较少，本文就产酸克雷伯菌的流行率、致病性及其相关机制进行了综述，希望能提高大家对产酸克雷伯菌的认识，并为疾病预防和治疗提供指导。