2022年 · 第45卷第05期

近年来，随着DNA测序技术的突破性发展，胚胎植入前遗传学检测（PGT）作为辅助生殖技术（ART）的一部分已经被广泛应用。下一代测序（NGS）技术的进步和分辨率的提高，分子诊断技术的综合应用，能够同时进行染色体筛查及小的基因片段缺失和重复检测，对于提高妊娠率、降低流产率、降低多胎率和畸形率等方面具有重要意义。常用PGT分子诊断技术包括荧光原位杂交（FISH）、单核苷酸多态性微阵列（SNP-array）、比较基因组杂交阵列（aCGH）、定量聚合酶链反应（qPCR）和下一代测序技术（NGS），在临床应用中各有侧重，存在诸多难以控制的不确定因素，还要关注技术进步带来的伦理问题。

目的 分析不育症男性患者血清降钙素基因相关肽（CGRP）水平和体外受精胚胎培养结局的相关性。 方法 对2019年7至10月于福建医科大学附属第一医院生殖医学中心就诊患者中随机抽样25例接受体外受精胚胎移植辅助生殖治疗的男性患者进行研究，以血清CGRP对数转化指标、受精方式、是否取精困难、年龄、不育年限、泌乳素等为自变量，以总受精率、正常受精率、D3优质胚胎率、囊胚形成率为因变量，运用Pearson相关分析和多元回归法，进行相关性分析。 结果 Pearson相关分析显示，原发不育组中D3优质胚胎率与精子正常形态率相关（r=0.537，P=0.048），囊胚形成率与精子密度相关（r=0.760，P=0.002），CGRP对数与总受精率相关（r=0.693，P=0.006）。在继发不育组中，总受精率及正常受精率与精子总数相关（r=0.614，P=0.042；r=0.611，P=0.046）。多元回归分析显示，在继发不育组中，正常受精率与精子总数、血清CGRP对数转换指标、精子正常形态率之间有线性关系，且精子总数、CGRP对数转化指标与精子正常形态率的标准化回归系数分别为0.2、-72.9、6.8。 结论 男性的血清CGRP、精子总数和精子正常形态率共同影响正常受精率。

目的 无创产前检测胎儿非整倍体（NIPT）自制血浆质控物的研制及其性能验证。 方法 对2019年1月1日到2021年6月30日来绍兴市妇幼保健院遗传咨询门诊就诊、并选择NIPT检测结果为阴性的孕妇随访新生儿性别，将对应储存的孕妇血浆分成男婴孕妇组19份、女婴孕妇组120份。顺序收集2020年9月至2021年9月的9 360例病例作为临床验证病例。第1步：用1例47岁未孕健康女性空白血浆作为基质，每管200 μl血浆分别加入5个不同体积（0.1、0.2、0.5、2.5和5 μl）的胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒自带的阳性DNA，根据检测结果选择0.5 μl的阳性DNA加样量。第2步：将男婴孕妇组血浆（19份）和女婴孕妇组血浆（20份）分别作为基质，每管（205 μl）加入0.5 μl的阳性DNA，发现女婴孕妇组血浆的检测结果重复性好，敏感度为100%。第3步：对120份女婴孕妇组血浆的自制血浆质控品进行性能评价，通过计算Z值、胎儿游离DNA浓度的CV值变化等指标来评价储存稳定性、基质均匀性、加入不同批号阳性DNA时的影响。 结果 女婴孕妇组混合血浆为基质重复性好，敏感度为100%，而男婴孕妇组留存血浆为基质的敏感度只有84%。批内重复性结果显示女婴孕妇组血浆作为基质中胎儿游离DNA浓度的CV值为3.9%；加入0.5 μl阳性DNA后，自制阳性血浆质控品的胎儿游离DNA浓度为5.63%±0.42%，Z值均>6，放置3个月，胎儿游离DNA浓度的CV值为7%。阳性DNA的批号不同，浓度会有差异，当阳性DNA的胎儿游离DNA浓度值低于10%时，要加入1 μl的阳性DNA。经2020年9月至2021年9月9 360例临床检测中的应用，发现所有阳性血浆质控物均呈阳性结果，患者21三体的阳性预测值为100%。 结论 成功研制NIPT自制阳性血浆质控物，初步实验结果证实重复性好，较为稳定，适合在临床上推广。

目的 研究1种基于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术的血清17α-羟孕酮（17α-OHP）候选参考测量程序并对其进行评价。 方法 2019年12月，取上海市临床检验中心员工体检留存的血清标本，采用正己烷乙酸乙酯混合液（体积比3∶2）提取加入同位素内标的血清样本，C18反向色谱柱分离，正离子电喷雾质谱仪检测，参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）C62-A文件对建立的候选参考方法进行校准曲线、检测限与定量限、基质效应、不精密度、正确度、特异性、携带污染、线性范围等基本分析性能验证。 结果 17α-OHP的线性范围为0.21~119.67 μg/L。检测限和定量限分别为5.218 ng/L、0.116 μg/L。3种不同比例50∶50、80∶20、20∶80）的血清与溶液混合物的相对基质效应分别为-0.02%、-0.40%、-0.90%。批内变异系数（CV）在0.164、14.81、81.63 μg/L浓度处分别为1.73%~2.11%、0.98%~1.71%、0.47%~0.87%，批间CV在上述3个浓度点处分别为1.82%、1.03%、0.80%。加标样本平均回收率在0.5、20、100 μg/L处分别为100.4%、101.7%、102.8%；检测中国计量科学研究院标准参考物质GBW09829，结果均在规定的不确定度范围内。无携带污染和特异性干扰。 结论 成功建立了基于同位素稀释LC-MS/MS技术的血清17α-OHP候选参考测量程序。该候选参考测量程序有着良好的精密度和准确度，能用于常规临床检验方法的量值溯源。

目的 建立本实验室血清孕酮同位素稀释液相色谱串联质谱（ID-LC-MS/MS）候选参考方法，并将其用于5种临床常规检测系统的性能评价，探讨不同检测系统检测血清孕酮的可比性。 方法 采用液液萃取的方法进行样本前处理，在正离子质谱模式下的反相液相分离检测人血清中孕酮，通过梯度洗脱，使单个样本检测时间控制在5 min内。为提高方法准确度，使用包括法建立标准曲线，根据美国临床和实验室标准化协会C62-A、EP15-A2、EP6-A2和EP9-A3等文件分别评价包括法和经典校准曲线法检测的灵敏度、正确度、精密度和特异度等性能，并评价5个血清孕酮临床常规检测系统的检测性能，与ID-LC-MS/MS法比较，评估其在医学决定水平2和25 ng/ml处的偏倚是否均<1/2允许总误差（TEa，12.5%）。 结果 本实验室血清孕酮ID-LC-MS/MS候选参考方法检测限为0.005 ng/ml，包括法和经典校准曲线法回收实验的回收率分别为97.95%~101.58%和96.88%~110.70%，包括法对认证标准物质的测量结果在其声明的不确定度范围内；包括法批内、批间变异系数（CV）均<3.0%，优于经典校准曲线法（2.48%~9.33%）。5种临床常规检测系统的精密度和线性范围均能达到要求；检测系统1、3和5在2和25 ng/ml处2个医学决定水平的测量结果偏倚不满足均<1/2TEa，检测系统2和4在2个医学决定水平的测量结果偏倚均<1/2TEa。 结论 本室建立的血清孕酮ID-LC-MS/MS候选参考方法分析性能符合要求，包括法较经典校准曲线法具有更好的检测性能；5种临床常规检测系统的精密度、线性评估良好，仅2个检测系统在2个医学决定水平的正确度评价能满足临床需求。

目的 分析尿石症患者血清与尿液的氨基酸代谢轮廓，寻找疾病相关的差异生物标志物，为临床早期筛查诊断提供可靠依据。 方法 病例对照研究。收集2015年2月至2017年10月福建医科大学附属第一医院泌尿外科确诊的74例尿石症患者（年龄20~82岁，男41例，女33例）和同期健康体检中心的35名健康对照者（年龄22~80岁，男20名，女15名）的血液与尿液样本。采用基于GC-MS的代谢组学研究策略，分别对患者与健康对照者的血清和尿液氨基酸水平进行分析，采用主成分分析与正交偏最小二乘-辨别分析（OPLS-DA）的多元统计分析方法进行建模，选择OPLS-DA模型的变量重要性投影值>1与t检验的P<0.05来筛选差异氨基酸代谢物，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析和二元Logistic回归分析推断潜在标记物的诊断效能。 结果 研究筛选出丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和甘氨酸等5种氨基酸代谢物在尿石症组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.05），且与7条代谢通路相关联。将血清丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和尿液甘氨酸、天冬氨酸组合成联合标志物组，其ROC曲线下面积为0.890，敏感度为78.0%，特异度为96.4%。 结论 共发现血清和尿液中的5种氨基酸可作为尿石症早期筛查诊断的生物标志物，为尿石症的分子基础研究提供一定的实验依据。

目的 建立基于同位素稀释液相色谱串联质谱法（ID-LC-MS/MS）同时测定人全血中4种免疫抑制剂环孢素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司的候选参考方法。 方法 分别采用环孢素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司同位素标记物为内标，重量法取样，标准曲线法进行定量；采用蛋白沉淀和固相萃取对制备的全血样本进行前处理，超高液相色谱-三重四级杆质谱检测。对方法的特异性、基质效应、检测限、定量限、批内变异系数（CV）、实验室内CV、加标回收率和不确定度等指标进行评价。 结果 方法选择性和特异性良好，结构类似物和基质效应均不影响检测结果。环孢素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司的检测限及定量限满足临床需求，批内CV为 1.4%~1.8%、1.7%~2.8%、1.3%~3.7%和2.3%~3.2%，实验室内CV为1.8%~2.9%、1.7%~3.8%、2.6%~4.7%和3.5%~4.6%，加标回收率分别为97.9%~100.3%、98.4%~103.1%、99.4%~102.0%和98.3%~99.4%。4个浓度质控品相对扩展不确定度分别为4.2%~4.4%、1.5%~2.4%、4.4%~4.9%和2.2%~2.7%。 结论 本研究建立了ID-LC-MS/MS测定全血中环孢素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司4种免疫抑制剂的方法，方法准确、精密、快速，有望成为候选参考方法。

目的 回顾性分析儿童神经母细胞瘤和横纹肌肉瘤的骨髓涂片，归纳总结2种肿瘤侵犯骨髓的细胞形态特点。 方法 收集中山大学肿瘤防治中心2013年1月至2020年7月门诊及住院患儿，经病理组织或淋巴结活检确诊为神经母细胞、横纹肌肉瘤的骨髓标本共908份，其中肿瘤骨髓转移检出231份，对其骨髓涂片进行观察，根据其肿瘤细胞的形态特点进行分析归类总结。 结果 2种肿瘤骨髓转移共检出231份，其中神经母细胞瘤检出217份，侵犯率34.23%；横纹肌肉瘤检出14例，侵犯率5.11%。神经母细胞瘤细胞呈假菊花团状或砌墙样排列、多数中心包裹着神经纤维丝，根据细胞大小可分成大细胞型和小细胞型。横纹肌肉瘤细胞以中等大小为主，细胞核可有空泡，可见双核、三核及多核；细胞质呈薄纱状、边缘可见串珠样空泡。依据两者的细胞形态特点可与急性白血病相鉴别。 结论 2种儿童恶性实体瘤中神经母细胞瘤骨髓侵犯率高，横纹肌肉瘤骨髓侵犯率较低。横纹肌肉瘤根据瘤细胞是否融合可初步区分胚胎型和腺泡型。

目的 评价PCR-流式荧光杂交技术在地中海贫血产前基因诊断中的诊断效能。 方法 回顾性分析2017年9月至2020年12月间于广东省妇幼保健院进行地中海贫血产前基因诊断的8 005份胎儿的样本，所有样本均经多重缺口-PCR、PCR-反向斑点杂交法、Sanger测序和多重连接依赖性探针扩增等方法确诊基因型，同时应用PCR-流式荧光杂交技术作为地中海贫血常见突变位点的验证平台进行平行检测。分析基因检测结果，并比较PCR-流式荧光杂交技术与传统方法对于地中海贫血常见突变位点的检测结果的诊断效能差异。 结果 传统方法共检出地中海贫血阴性样本1 939份，阳性样本6 066份，其中包括α-地中海贫血4 513份、β-地中海贫血1 475份以及αβ-地中海贫血78份。经软件首次判读，PCR-流式荧光杂交方法共判读成功7 845份，与传统方法比较，其敏感度、特异度和准确度均为100%。首次判读失败的160份样本经复检或人工复核数据后均可成功正确判读。 结论 PCR-流式荧光杂交方法与传统方法对于地中海贫血产前基因诊断中常见突变位点的诊断效能无差异。

目的 对1个遗传性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷症家系新发现的基因突变进行分子致病机制研究。 方法 先证者因“肝内胆管结石”于2021年9月就诊于温州医科大学附属第一医院，患者平素无自发性出血症状。收集该先证者及其家系成员（共3代10人）的临床资料和血液样本，采用一期凝固法检测血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）和FⅪ活性（FⅪ：C），酶联免疫吸附实验（ELISA）检测FⅪ抗原（FⅪ：Ag）；采用DNA直接测序法对F11基因进行分析。运用生物信息学软件辅助分析突变对蛋白结构和功能的影响。构建野生型和突变型FⅪ蛋白表达载体，瞬时转染HEK293T细胞；提取阳性转染细胞内的总RNA，将RNA逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测转染细胞内F11基因的mRNA表达水平；采用ELISA法和蛋白免疫印迹实验分别检测转染细胞裂解液及培养上清液中FⅪ：Ag含量和FⅪ蛋白表达量。 结果 先证者APTT为107.9 s（参考范围29.0~43.0 s），FⅪ：C和FⅪ：Ag明显下降，分别为2%（参考范围84%~122%）和5%（参考范围76%~127%）。基因分析显示先证者F11基因第6号外显子存在c.536C>T（p.Thr161Met）杂合错义突变及第13号外显子存在c.1556G>A（p.Trp501Ter）杂合无义突变。生物信息学分析显示，在5种不同物种组成的矩阵中FⅪ蛋白161位点氨基酸均为苏氨酸（Thr），表明Thr161位点在不同物种同源基因间高度保守，p.Thr161Met杂合突变会影响FⅪ蛋白局部分子间结构稳定性。p.Thr161Met突变对F11基因转录水平没有影响，但突变导致FⅪ：Ag含量和FⅪ蛋白表达量在细胞培养上清液中明显低于野生型表达载体，在细胞裂解液中高于野生型表达载体，即p.Thr161Met突变导致FⅪ蛋白分泌障碍。 结论 p.Thr161Met杂合错义突变和p.Trp501Ter杂合无义突变与该家系FⅪ水平降低有关。p.Thr161Met杂合错义突变不影响FⅪ蛋白的合成，可能导致分泌障碍。

目的 探讨谷胱甘肽转移酶mu5（GSTM5）启动子区甲基化状态在骨髓增生异常综合征（MDS）发生发展中的作用，为MDS的早期诊断提供新的潜在分子标记物。 方法 收集2018年10月至2021年6月在解放军总医院血液科初诊的40例MDS［MDS伴单系发育异常（MDS-SLD）5例，MDS伴多系发育异常（MDS-MLD）7例，MDS伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）6例，MDS伴原始细胞增多Ⅰ型（RAEB1）13例，MDS伴原始细胞增多Ⅱ型（RAEB2）9例］患者、8例MDS转化为急性髓系白血病（sAML）患者和6例对照（4例缺铁性贫血、2例营养性巨幼细胞性贫血）患者的骨髓血标本。采用Agena MassARRAY核酸质谱技术对3组标本进行GSTM5基因启动子区甲基化的定量检测。采用Wilcoxon非参数检验比较不同组GSTM5基因甲基化水平。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价试验的特异度、敏感度和准确度。 结果 聚类分析结果显示，MDS组GSTM5甲基化率高于对照组［0.50（0.27，0.79）比0.29（0.10，0.45），P<0.05］；sAML组GSTM5甲基化率明显高于MDS组［0.67（0.36，0.86）比0.50（0.27，0.79），P<0.05］。分析各CpG位点甲基化率的差异，在CpG_1、CpG_4，5、CpG_6，7，8、CpG_11、CpG_13，14、CpG_15、CpG_16、CpG_22和CpG_24位点，MDS组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。ROC曲线分析结果显示，在CpG_6，7，8单位曲线下面积最大，AUC=0.861（95%CI 0.717~1.000，P<0.05），敏感度和特异度分别为85%和83%。分析GSTM5甲基化与MDS疾病发展的关系，在骨髓原始细胞较高组和高危亚组（RAEB）中GSTM5基因甲基化水平较高。 结论 GSTM5基因启动子区甲基化在MDS中较常见，并且在MDS发生发展过程中可能起重要作用，可作为诊断MDS的潜在肿瘤标志物。

上皮样血管内皮瘤（EHE）是一种罕见的恶性血管肿瘤，其恶性程度介于完全良性的血管瘤和高度恶性的血管肉瘤之间，起源于血管内皮细胞或前内皮细胞，以上皮样或组织细胞样外观的血管内皮细胞增殖为特征。EHE在所有血管肿瘤中发病率<1%，可发生于身体多个部位，最常发生于肝脏，其次是肝和肺同时受累、肺单独受累、骨单独受累。目前在国内未见报道通过骨髓细胞形态学检查诊断EHE的病例。该患者通过骨髓细胞形态学检查发现异常细胞，指引临床下一步诊疗方向，最终诊断为EHE，骨髓细胞形态学检查为临床进一步诊疗提供重要依据。上皮样血管内皮细胞瘤需要与多种良恶性血管源性肿瘤相鉴别，尤其与其他类型的上皮样血管源性肿瘤鉴别困难。目前已经发现该病有特征性的细胞遗传学和分子生物学异常，结合病理组织学形态和免疫组织化学检查，综合考虑可以做出诊断与鉴别诊断。

全球约15%的育龄人口患有不孕不育症，该症将成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的第三大顽疾。在不孕不育病因中，男性因素约占一半，而遗传因素作为男性不育的主要病因之一，是近年来生殖领域的研究热点。精准分析男性不育的遗传病因并制定针对性诊疗方案，是解决当前社会高生育需求和人口下降等问题的有效手段。