2021年 · 第44卷第08期

液相色谱-串联质谱技术在检验医学领域正在快速应用与发展，从高分辨质谱促进生物标志物的高效筛选，到三重四极杆质谱助力验证生物标志物对疾病的诊断与疗效监测，其应用贯穿于组学研究到实验诊断的不同领域与环节，逐渐成为疾病研究与诊断的一种不可或缺的技术手段。目前大部分液相色谱串联质谱平台处于医学研究阶段，临床推广与应用还存在一些挑战。

在质谱检测过程中，有部分目标分析物由于离子化效率低、化学稳定性不佳等原因难以通过直接分析得到高质量的定量结果。为提升检测效率，利用化学衍生技术修饰其分子结构成为关键。此项技术涉及检验医学、有机化学、分离科学等多学科交叉，在方法学建立和评价方面对实验室人员的专业水平提出较高的要求。近年来，化学衍生技术已开始广泛应用于对维生素、激素、神经递质、治疗性药物等多个项目的检测中，是未来临床质谱发展的重要方向。

随着检验技术的不断发展，肾上腺偶发瘤（AI）的诊出率不断提升。在临床诊疗中，基于液相色谱-串联质谱技术进行相关激素检测可评估该类患者的肿瘤有无内分泌功能。液相色谱-串联质谱技术具备高灵敏度、高特异性、多组分的优势，已成为检测小分子激素的金标准方法。质谱技术在糖皮质激素、盐皮质激素、性激素及儿茶酚胺代谢产物中的检测具有优势。LC-MS/MS在临床实践中尚存在部分不足，具体表现为自动化程度低、标准化缺乏等。在完善LC-MS/MS临床应用和参考范围建立的工作后，临床对AI内分泌功能的判断必将更加规范。

准确测定患者体内药物浓度是做好治疗药物监测（TDM）工作，实施精准化药物治疗的必要前提，也是临床实验室的重要工作内容之一。TDM在免疫抑制剂（如环孢素A、他克莫司）、精神药物（如丙戊酸、卡马西平）和其他需要进行药物浓度监测的药物中都对临床治疗发挥着重要作用。用于TDM的血药浓度检测方法类别多，目前只有部分免疫学检测方法具备了经过批准的配套检测系统和试剂盒，但是大部分TDM项目的药物浓度检测方法属于高效液相色谱、液相色谱-串联质谱等技术，都是自建方法（LDT）。资料显示，同一检测项目不同检测方法之间的检测结果存在明显差异，同一方法不同实验室之间的检测结果也存在明显差异，究其原因，有以下几个方面：（1）TDM检测结果尚未实现量值溯源；（2）检测方法尚未实现标准化；（3）EQA计划的覆盖面不足；（4）TDM实验室参加EQA计划的意识不够；（5）TDM标准化尚处于初级阶段。这些问题制约了TDM的临床应用及相关研究工作的开展。为了解决这些问题，需要：（1）建立参考系统，实现检测结果量值溯源；（2）在逐步增加TDM EQA计划项目的同时，也要尽快开展正确度评价计划；（3）规范TDM样本检测技术；（4）加强实验室管理，建立完善的质量管理体系。

原发和多种转移肿瘤浸润中枢神经系统（CNS），因CNS的特殊结构，脑脊液（CSF）的实验室检测在CNS相关疾病的诊断中发挥重要作用，利用流式细胞术（FCM）检测CSF中的肿瘤细胞是评价CNS肿瘤累及的重要技术，为了规范操作，加强质量控制，中国中西医结合学会检验医学专业委员会制定此专家共识。

活化部分凝血活酶时间（APTT）延长混合血浆纠正试验用于鉴别凝血筛选试验中APTT延长的原因——凝血因子缺乏或存在凝血抑制物。该试验有助于医生结合患者临床表现初步判断患者APTT延长异常的原因，以及针对性选择下一步实验室检查项目，所以是有重要价值的凝血试验。目前，因该试验的操作流程及结果解读暂无统一标准，实验室应用较为混乱，结果缺乏可比性，也限制了其应用和普及。本共识参考国内外相关文献，结合出凝血检验领域专家的实践经验，致力于推进APTT延长混合血浆纠正试验的标准化。

在新型冠状病毒肺炎防控工作中，为缩短检测时间，减少实验过程中所需的辅助仪器设备、降低对实验室空间大小的要求，临床上开始出现向即时检测（POCT）发展的新型冠状病毒核酸检测方法。由于这些方法尚未达到理想的POCT要求，本共识暂时以行业内普遍使用的“快速检测”来描述。为规范新型冠状病毒核酸快速检测的临床应用，中国医学装备协会基因检测分会、中国医学装备协会现场快速检测（POCT）装备技术分会、国家医学检验临床医学研究中心、国家卫生健康委能力建设和继续教育中心检验医学专家委员会分子学组和北京市医学检验质量控制和改进中心制定该共识。该共识中的声明内容包括实验室总体要求、标本的采集、运送和保存、标准操作程序及性能验证、室内质量控制、室间质量评价、结果分析和报告、实验室安全管理等。

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法检测血浆咖啡因浓度，评价咖啡因药物浓度监控（TDM）在早产儿呼吸窘迫综合征（RDS）治疗中的临床应用价值。 方法 取血浆样本于离心管中，加入咖啡因氘代同位素内标，再加入蛋白沉淀剂，充分涡旋混合后，离心取上层清液进入质谱分析。流动相为甲醇和水，梯度洗脱；柱温45 ℃，使用岛津LC-30AD-CL液相系统和AB SCIEX 4500 QTRAP质谱仪建立方法，并对该方法的敏感度、特异度、线性、准确度、不精密度、基质效应、携带污染进行评估。纳入2021年2至4月就诊于武汉大学人民医院新生儿科诊断为新生儿RSD的患者30例，检测不同RDS早产儿相同给药方案下的咖啡因谷值浓度以评估个体变异对咖啡因药物浓度的影响。 结果 咖啡因的检出限为0.02 μg/ml，最低定量限为0.05 μg/ml，在1.0~100.0 μg/ml浓度范围内表现出良好的线性（R2=0.998 6，R>0.99）、特异度（回收率85.52%~114.12%）、准确度（回收率85.97%~114.53%）、日内和日间不精密度（CV 6.01%~11.28%），基质效应和携带污染可忽略不计。检测30例RSD早产儿相同给药方案（10 mg/kg）后的咖啡因谷值浓度为（25.45±11.61）μg/ml，变异系数为44.88%。 结论 成功建立了一种UPLC-MS/MS方法用于监测咖啡因血药浓度。咖啡因TDM具有一定的临床应用价值，可用于辅助RDS诊疗，提高咖啡因疗效。

目的 探讨外泌体miR-218-5p在结直肠癌（CRC）患者血清中的表达水平及其与患者临床病理特征的相关性，评价其在CRC中的诊断效能。 方法 选择同济大学附属同济医院2016年10月至2018年10月确诊的结直肠癌病例组78例，术前采血并保存血清；选择同期健康体检者40例作为对照组。采用ExoQuick试剂盒提取血清外泌体，应用透射电镜、NTA、蛋白印迹对外泌体进行形态学和分子表型鉴定；利用miRNeasy试剂盒提取血清外泌体中总RNA，实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）检测各组血清外泌体miR-218-5p的表达水平。以miR-218-5p相对表达水平的中位数为截断值，将CRC患者分为高表达与低表达组，用χ²检验判断其与临床病理特征的关系；受试者工作特征（ROC）曲线判断其在结直肠癌中的诊断效能。 结果 试剂盒法成功提取到血清中的外泌体。结直肠癌组血清外泌体miR-218-5p的表达水平明显低于对照组［0.566（0.364，0.850）比1.054（0.781，1.709），P<0.001］；其低表达程度与肿瘤大小、TNM分期、肿瘤淋巴结转移和浸润深度显著相关（P均<0.05）；ROC分析表明血清外泌体miR-218-5p诊断结直肠癌的曲线下面积（AUC）为0.827（95%CI 0.754~0.900），明显优于常规的肿瘤标志物癌胚抗原CEA（AUC=0.718，95%CI 0.626~0.811）和糖类抗原CA199（AUC=0.661，95%CI 0.564~0.758）。 结论 结直肠癌患者血清外泌体中 miR-218-5p的表达下调与多个不良临床病理学因素相关，具有成为结直肠癌诊断生物标志物的潜力。

目的 设定符合当前我国血清叶酸分析质量水平的室间质量评价（EQA）允许总误差（TEa）。 方法 收集2016年北京医院检验科血清叶酸检测数据，使用Stata SE 15软件进行蒙特卡洛模拟，得到不同偏倚和不精密度条件下假阴性率的大小，并使用Origin Pro 9.1软件作等值线图，根据可接受的假阴性率标准导出血清叶酸检测方法的TEa。收集2020年全国血清叶酸EQA数据，分别计算基于分析性能对临床结果的影响、基于生物学变异以及我国EQA评价标准导出的5种TEa下，参与实验室及格率和各水平质控品的实验室通过率。 结果 基于分析性能对临床结果的影响导出的TEa为10%，在此TEa下，2020年第一次EQA血清叶酸实验室及格率>80%，第2次及格率为73.1%。在基于生物学变异导出的最低（46.57%）、适当（31.05%）和最佳水平TEa（15.52%）和我国EQA评价标准下，2020年2次EQA计划血清叶酸实验室及格率均>85%。 结论 我国实验室血清叶酸检测水平尚不能满足基于分析性能对临床结果的影响导出的TEa要求，建议使用基于生物学变异导出的最佳TEa水平（15.52%）作为血清叶酸TEa的推荐标准。

目的 探讨淋巴细胞绝对值（ALC）在预测骨髓增生异常综合征（MDS）患者临床预后中的价值。 方法 对2009年至2019年来宁波市第一医院就诊的245例MDS患者进行回顾性分析，按WHO 2016标准重新诊断分型，并参照国际预后指数评分系统修改版（IPSS-R）对其中208例资料完整的患者进行危险分层，收集和分析所有患者的外周血ALC，运用R语言生存分析模型受试者工作特征包绘制时间依赖性受试者工作特征曲线，获得ALC的最佳临界值为1.0×109/L，将患者分为正常ALC组（ALC≥1.0×109/L）和低ALC组（ALC<1.0×109/L）。采用χ²检验和非参数Mann-Whitney U检验分析两组患者一般资料的差异。采用Kaplan-Meier法绘制总生存期（OS）及无白血病生存期（LFS）曲线并进行Long-rank检验对两组进行生存比较，采用Cox回归模型多因素分析影响MDS预后的因素。 结果 低ALC组患者97例，正常ALC组患者148例。低ALC组患者OS较正常ALC组更短（15个月vs 60个月，P<0.000 1），在IPSS-R评分系统中评分更高（5.0分vs 3.75分，P=0.001）。在对IPSS-R中危组患者进行多因素分析时发现，ALC（<1.0×109/L）是影响OS的独立危险因素（HR：2.672，95%CI：1.090~6.548，P=0.032）。 结论 本研究显示MDS患者外周血ALC对于中危组患者是独立的危险因素之一，为机体免疫对MDS发生发展的影响提供临床证据。

目的 探讨急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患儿外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）和辅助性T细胞17（Th17）的表达情况及其比值变化规律。 方法 选取2017年2月至2019年10月首都儿科研究所附属儿童医院初发急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患儿54例为研究对象，年龄4.9（3.1，7.4）岁。分为治疗前组和治疗后组，治疗后根据疾病转归分为完全缓解组45例，复发/难治组9例，选取20名查体儿童为对照组。运用流式细胞术（FCM）分别检测B-ALL患儿治疗前后和查体儿童外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞和Th17细胞占CD4+T细胞的比例，并计算Treg/Th17细胞比值。在治疗前后分别比较复发/难治组、完全缓解组和对照组之间Treg、Th17细胞比例及Treg/Th17比值。分别比较完全缓解组和复发/难治组同一患儿治疗前后检测指标差异。 结果 B-ALL患儿治疗前，复发/难治组和完全缓解组外周血Treg细胞比例（分别为6.11±0.48，6.20±1.16）高于对照组（4.89±1.46），Treg/Th17细胞比值（分别为8.34±2.14，5.91±1.92）高于对照组（3.55±1.68），复发/难治组外周血Treg/Th17细胞比值高于完全缓解组，其差异均有统计学意义（P<0.05）。B-ALL患儿治疗后，复发/难治组外周血Treg细胞比例（6.09±0.80）高于完全缓解组（5.25±0.87）及对照组（4.89±1.46），Treg/Th17细胞比值（7.37±1.19）高于完全缓解组（4.22±1.50）及对照组（3.55±1.68），其差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗后，完全缓解组患儿外周血Treg细胞比例及Treg/Th17细胞比值均低于治疗前，Th17细胞比例（1.38±0.49）高于治疗前（1.14±0.39），其差异均有统计学意义（P<0.05）。复发/难治组外周血Treg细胞及Treg/Th17细胞比率与治疗前比较，其差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论 B-ALL患儿外周血存在CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞升高和Th17细胞比例降低所致的Treg/Th17细胞比值改变，随疾病的缓解而趋于正常。定期检测Treg细胞及Th17细胞比例有助于对B-ALL患儿进行免疫状态监测及预后判断，可能为B-ALL的免疫治疗提供依据。

目的 探讨急性自发性脑出血患者血清碱性磷酸酶（ALP）的变化及其临床意义。 方法 回顾性分析天津市第三中心医院神经外科于2019年1月至2020年10月收治入院的急性自发性脑出血患者81例（脑出血组），并选择同时期来自健康体检中心或以头晕等为主诉、且无肝胆及骨骼疾病住院的性别、年龄相匹配的非脑出血患者81例为对照组；记录所有纳入者的临床资料［包括性别、年龄、格拉斯哥昏迷量表（GCS）评分、血肿部位、肝功能指标、高血压史、糖尿病史、心脏病史、吸烟史、饮酒史等］，比较两组临床资料的差异；Pearson相关分析肝功能指标和GCS评分的相关性；二分类Logistic回归分析脑出血的危险因素；利用受试者工作特征（ROC）曲线评估血清ALP预测脑出血的价值。 结果 急性自发性脑出血患者血清ALP水平［85.0（70.0，103.0）］ U/L，显著高于对照组［65.0（54.5，71.5）］ U/L（Z=6.740，P<0.001）。Pearson相关分析结果显示，血清ALP与GCS评分（r=0.255，P=0.022）负相关。二分类Logistic回归分析显示高血压（OR=20.440，95%CI 8.572~48.737）和ALP（OR=1.077，95%CI 1.049~1.105）是脑出血发生的危险因素。在校正年龄、AST、高血压病史后，结果显示，血清ALP是脑出血发生的独立危险因素（OR=1.069，95%CI 1.038~1.101）。ROC曲线显示血清ALP预测脑出血的曲线下面积为0.807（95%CI 0.740~0.873，P<0.001），敏感度为67.9%，特异度为81.5%。 结论 血清ALP水平可能与急性自发性脑出血的发生和病情严重程度相关。因此，血清ALP水平可作为评估急性自发性脑出血发生、病情严重程度的参考指标。

目的 建立同位素稀释液相色谱串联质谱法（ID-LC/MS/MS）测定人血浆甲氧基去甲肾上腺素的候选参考方法，并对方法性能进行评价。采用该方法对室间质量评价计划样品进行定值，初步评价血浆甲氧基去甲肾上腺素的检测现状。 方法 采用甲氧基去甲肾上腺素同位素标准溶液为内标，重量法进行取样，标准曲线法进行定量；采用蛋白沉淀结合弱阳离子固相萃取进行前处理，采用超高液相色谱耦联三重四极杆质谱仪进行液质联用分析。根据相关EP文件对方法的特异性、基质效应、检测限、定量限、精密度、正确度和不确定度等性能指标进行了评价。采用该方法对2020年国家卫生健康委临床检验中心甲氧基去甲肾上腺素室间质量评价计划样品进行定值，以该定值结果为靶值，生物学变异最佳可允许总误差标准为评价限，对实验室的检测质量进行评价。 结果 方法特异性良好，干扰物和基质效应均不影响检测结果。血浆甲氧基去甲肾上腺素测定的检测限及定量限分别为1.08 pg/g和3.54 pg/g，批内变异系数（CV）和批总CV分别为0.43%~1.10%、0.61%~1.42%，相对回收率为98.5%~101.9%，4种血浆样品的相对扩展不确定度分别为3.10%、2.34%、2.16%、1.73%。室间质量评价计划结果显示，实验室测定202013和202014样品的及格率分别为80%和85%。 结论 本研究建立了ID-LC/MS/MS测定人血浆甲氧基去甲肾上腺素的候选参考方法，方法准确、精密、简便，有望作为血浆甲氧基去甲肾上腺素测定的参考方法，可应用于室间质量评价计划样本的定值。

目的 调查分析基于中国罕见病注册系统中脊髓性肌萎缩症（SMA）队列人群相关基因诊断技术的应用现况和发展趋势。 方法 本项横断面调查研究以2016年7月至2018年12月在首都儿科研究所注册登记的200例SMA患儿为研究对象，通过查阅注册信息、基因检测报告以及电话随访等方式获得患儿基本信息、疾病分型、基因型、基因诊断相关信息等。按照检测时间分层后，分别统计采用不同基因诊断技术的人数和构成比，采用Pearson相关分析基因诊断技术的应用与时间的相关性。 结果 除3例资料不全的病例，共纳入197例SMA病例。SMAⅠ、Ⅱ和Ⅲ型的患儿分别为37例（18.8%）、115例（58.4%）和45例（22.8%），SMN1基因纯合缺失和复合杂合变异病例分别为185（93.9%）和12例（6.1%）。2004—2017年SMA基因诊断技术有7种：以多重连接探针扩增技术（MLPA）为主，占54.1%（100/185），其次是聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和一代测序，分别为22.7%（42/185）和10.3%（19/185），等位基因特异性PCR（AS-PCR）、实时定量PCR（qPCR）、全外显子组测序（WES）及变性高效液相色谱分析（DHPLC）分别9、6、5和4例，占2.2%~4.9%。MLPA的应用从2010年开始逐步增加（r=0.95，P<0.05），而PCR-RFLP从2004年开始逐步下降（r=-0.99，P<0.05），其他检测方法应用与时间暂未发现相关性（P>0.05）。定量检测技术（MLPA、qPCR和DHPLC）的应用从2010年开始逐渐增高（r=0.94，P<0.05），定性检测技术（PCR-RFLP、一代测序、AS-PCR和WES）从2004年开始逐渐下降（r=-0.94，P<0.05）。纯合缺失与复合杂合变异的基因重复检测率分别为12.4%（23/185）和41.7%（5/12），差异有统计学意义（χ²=5.86，P<0.05）。基因检测结果显示，同时提供SMN1、SMN2基因定量分析报告的构成比在2008—2015年为56.8%（21/37），2016—2017年上升至69.1%（56/81）。 结论 SMA基因检测技术从定性检测技术逐步发展为以MLPA和qPCR为主的定量检测技术。SMA定量检测报告不仅提供了SMN1致病基因的定量结果，也提供了SMN2修饰基因的定量结果。

目的 分析河南省患者来源单核细胞增生李斯特菌的血清学和分子分型，了解河南省李斯特菌病流行情况，构建患者分离株分子溯源数据库，为李斯特菌病溯源提供实验室依据。 方法 参照国家食源性疾病监测工作手册，2015年1月至2020年7月河南省单核细胞增生李斯特菌感染病例专项监测从16家哨点医院监测李斯特菌病阳性病例71例，采集阳性病例标本80份进行检测，对获得的阳性菌株71株进行分子分型，参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准单核细胞增生李斯特菌血清分型方法（SN/T 2521-2010）和单核细胞增生李斯特菌诊断血清使用说明书对获得的80株单核细胞增生李斯特菌进行血清学分型，参照国家食源性疾病分子溯源网络使用手册进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PFGE）聚类分析。 结果 共监测到71例李斯特菌病阳性病例，其中38例为围产期病例，33例为非围产期病例。80份李斯特菌病阳性病例标本58.75%（47/80）来自围产期病例，20.00%（16/80）来自非围产期有基础病病例；来自于非围产期年龄>1个月~≤5岁、>5~≤60岁和>60岁人群分别为7.50%（6/80）、12.50%（10/80）和1.25%（1/80）。标本类型分为5类，73.75%（59/80）为血液，15.00%（12/80）为脑脊液，粪便、宫腔拭子、痰液各占3.75%（3/80）。对获得的80株单核细胞增生李斯特菌进行血清学分型，分属3个血清型，1/2b型、1/2a型和4b型分别占61.25%（49/80）、35.00%（28/80）和3.75%（3/80）；71株单核细胞增生李斯特菌经AscⅠ酶切，获得58种带型，每种带型包括1~4株菌株，相似度为60.8%~100%。GX6A16HA0005、GX6A16HA0011、GX6A16HA0030、GX6A16HA0023、GX6A16HA0029和GX6A16HA0054为优势带型，依次包括4、4、4、3、2和2株菌；GX6A16HA0005带型包括的4株菌分离自2016、2018和2020年，其中2016年（1株）和2018年（1株）均来自濮阳市；GX6A16HA0011带型包括的4株分离自2016、2018和2020年，其中2020年2株均来自洛阳市；GX6A16HA0030带型包括的4株均分离自2018年，分别来自洛阳市、商丘市和郑州市；GX6A16HA0023带型包括的3株菌分离自2017和2018年，其中2017年中1株和2018年1株均来自洛阳市；GX6A16HA0029带型包括的2株菌均分离自2018年，分别来自开封市和濮阳市；GX6A16HA0054带型包括的2株菌均分离自2020年，分别来自平顶山市和安阳市；4株不同血清型菌株PFGE带型相同。 结论 河南省李斯特菌病病例主要集中在围产期、老幼及免疫力低下人群，感染类型主要是侵袭性感染；流行菌株血清型为1/2a、1/2b和4b，菌株PFGE分型结果呈现多样化，出现跨年度或者同年度不同地区、同年度同地区不同时间带型一致现象；应将多种分型技术联合应用在溯源分析中。

单细胞蛋白组学分析能够对细胞异质性进行深层次研究，进一步推动精准医疗和肿瘤研究等领域发展。近年来，基于质谱的蛋白质组学取得重大进展，然而在单细胞水平进行蛋白质组学分析仍然面临着灵敏度挑战。目前液相色谱-串联质谱已成为蛋白质组学主要分析方法，由于其具有高灵敏度，高通量，高稳定性等特点，在单细胞领域得以广泛推广。近几年具有代表性的单细胞蛋白质组学方法，根据样品处理方式的不同，可以分为单管技术、微流控平台、集合处理平台三类。不同的数据采集和分析方法各有优劣。单细胞蛋白质组学目前还停留在实验室研究，若能早日在临床应用，必将推动精准医疗和肿瘤学研究进步发展。

遗传性出血和血栓性疾病（BTD）是一组与凝血系统、血小板功能和纤溶系统相关的异质性疾病。除常见BTD外，常规实验室诊断这类疾病有很大难度，常需要进行特殊的实验检查方能明确诊断。因此，可能会延误患者的诊治，甚至危及生命。随着高通量测序（HTS）技术在临床实践中使用得愈发普遍，BTD的诊断和鉴别诊断有了长足的进步。