2004年 · 第27卷第07期

本刊为中华医学会主办的中华系列杂志之一。是我国检验医学(实验诊断学)专业最重要的核心期刊，被国内外20多个权威检索机构或数据库收录，影响因子居我国医药卫生类期刊前位。本刊以中高级检验医学或实验室诊断技术人员及临床医师为主要读者对象，报道我国检验医学或实验诊断领域先进的科研成果和国外重要进展。本刊设有：述

血液病的诊断需要以实验室所提供的检验结果或数据作为诊断的客观依据.随着生物医学技术的发展和各学科间的相互渗透,血液病的实验室诊断发展迅速,尤其是近年来我国在该领域已取得了令人瞩目的成就.例如:从检测血液、骨髓的细胞数量和形态学、免疫学、生物化学、遗传学、细胞和分子生物学等方法的不断建立和完善,到血液病实验诊断项目的不断增加和更新,从简单的实验诊断项目如血细胞计数及形态学观察,发展成为多种方法、多种技术和多学科融合的检测项目,并建成配备有各种先进的自动化精密仪器的血液病实验诊断体系;使我国很多医院的血液病实验诊断水平已达到或接近发达国家的同等水平[1]。

1989年有关文献报道,耳炎差异球菌被从慢性中耳炎患者的中耳渗出液(media ear effusion,MEE)中分离,并对这些细菌的生物学特性进行了描述,认为这些细菌是在低G+C含量革兰阳性球菌中,但未正式命名.1992年,Aguirre等[1]通过16S rRNA序列分析,将其正式命名为差异球菌属(Alloiococcus),耳炎差异球菌(A.otitis).1993年,yon Graevenitz[2]将其修正命名为A.otitidis.该菌DNA的G+Cmol%为44～45,模式株NCFB2890.目前,已知的差异球菌属仅有耳炎差异球菌1个菌种,被认为是健康人外耳道的正常菌群之一,与慢性渗出性中耳炎(otitis media with effusion,OME)有关。

目的 研究外周血T淋巴细胞核仁区嗜银蛋白(AgNORs)染色对传染性非典型肺炎(SARS)的临床意义.方法确诊SARS患者14例非SARS肺炎和正常对照各8例,抽取外周血,PHA刺激外周血T淋巴细胞培养,KL型肿瘤免疫图像分析系统分析AgNORs区面积与细胞核仁区的百分比(I.S%),计算活化T细胞的百分率.结果 I.S%和活化率分别为:8名正常对照组为7.38%±0.75%和63.64%±11.65%,8例非SARS肺炎患者为8.98%±0.91%和57.14%±12.49%,14例SARS患者为4.13%±3.24%和10.64%±8.30%,出院后1个月随访患者5例为10.80%±0.33%和65.89%±12.13%.病情危重的患者活化细胞率为0,提示T细胞功能几乎完全丧失;处于恢复期的患者T细胞免疫功能仍未恢复到正常;治愈出院1月后随访患者的T细胞免疫功能恢复到高于正常水平.结论 AgNORs测定对SARS患者的诊断、病情监测、出院和康复评价有一定的指导意义。

目的 利用自行设计的引物、探针和新型铕螯合物BHHCT,建立一种半定量丙型肝炎病毒(HCV) RNA的检测方法.方法收集44份丙型肝炎病人血清,20份正常人血清.利用中山大学达安基因有限公司RNA提取试剂提取HCV RNA,用自行设计的引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR).扩增产物cDNA与微孔板上的捕捉探针杂交后,借助于其上游引物5′端带有的生物素,与标记有铕的链霉亲合素特异性结合,将铕连接到微孔板上,在特定波长激发光激发下,发出荧光,进行检测.结果铕标记HCV RNA检测法的线性范围为102～106 cDNA拷贝,敏感性、特异性均为100%.结论铕标记RT-PCR检测HCV RNA法的线性范围宽,敏感性、特异性好,检测时间短,无放射性污染,有推广应用的价值。

目的 探讨RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因mRNA表达水平和基因启动子区CpG岛甲基化程度及其与启动子甲基化的关系.方法用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测28份胶质瘤组织和4份正常脑组织中RASSF1A基因mRNA相对表达水平;用甲基化特异性PCR方法研究胶质瘤组织、正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态.结果RASSF1A mRNA在4份正常脑组织中全部表达;在脑胶质瘤中表达缺失率为21.4%(6/28),且表达量低于正常脑组织,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度间的差异无显著意义(P＞0.05).按病理学分类,胶质母细胞瘤与少突胶质肿瘤的差异有显著意义(P=0.011).脑胶质瘤中RASSF1A基因启动子发生甲基化的频率为39.3%(11/28),正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子未发生甲基化.11份启动子区甲基化的胶质瘤标本中,5份同时伴mRNA表达缺失(P=0.022).结论RASSF1A基因启动子在胶质瘤中发生异常甲基化.尽管RASSF1A mRNA在脑胶质瘤中表达缺失并不广泛,但其表达普遍下调.推测启动子区CpG岛甲基化可能是导致RASSF1A基因在胶质瘤中表达缺失或表达水平下调的一种机制。

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)、P53和细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白表达与垂体腺瘤的侵袭性和复发的关系.方法应用免疫组化染色方法检测VEGF、P53和PCNA蛋白在30例侵袭性垂体腺瘤及30例非侵袭性垂体腺瘤中的表达.结果侵袭组中VEGF和PCNA蛋白的表达阳性率分别为16/30 (53.3%)和13/30 (43.3%),非侵袭组中分别为8/30 (26.7%)和5/30 (16.7%),两种蛋白的表达水平侵袭组明显高于非侵袭组(P<0.05).P53蛋白表达阳性率在两组中分别为 7/30 (23.3%)和0/30(0%),两组差异有显著意义(P<0.01).复发组的VEGF、P53和PCNA蛋白表达阳性率在第一次手术组分别为5/9 (55.5%)、2/9(22.2%)、5/9(55.5%),在第二次手术组分别为5/9(55.5%)、5/9(55.5%)和4/9(44.4%);非复发组分别为6/21(28.5%)、0/21(0%)和4/21 (19.0%).复发组VEGF和PCNA蛋白表达与非复发组比较,差异有显著意义(P<0.05),而两次手术组间比较无差异;P53蛋白表达在第一次手术组与非复发组间的差异也无显著意义(P>0.05),但第二次手术组则明显高于非复发组(P<0.01).结论 VEGF、P53和PCNA蛋白异常表达与垂体腺瘤的发生、侵袭和复发改变有关,检测这3项指标可对肿瘤侵袭和预后进行评价。

目的 建立一种新的荧光原位杂交法,快速鉴定血培养中的金黄色葡萄球菌(金葡菌)和凝固酶阴性葡萄球菌.方法将荧光同位素标记的针对金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌的核糖体16SrRNA序列的互补的DNA寡核苷酸探针,在同一张玻片上50℃杂交1 h,用杂交缓冲液50℃洗涤10min,干燥后置荧光显微镜下观察,全过程大约2 h.结果探针的特异性经标准菌株和临床分离菌株证实.将259份临床标本测试与培养法比较,金葡菌的特异性和敏感性均为100%,CoNs的特异性和敏感性分别为100%和95.5%,荧光原位杂交法的最低检出限为103 CFU/ml.结论本方法适用于血培养中的金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌的快速鉴定。

目的 探讨慢性乙型肝炎患者外周血CD8淋巴细胞亚型与其临床状态及HBV复制的关系.方法采用流式细胞技术多色荧光分析法,检测了18名健康体检者和107例慢性乙型肝炎患者外周血CD8淋巴细胞CD45RO、CD45RA和CD28的表达及病毒载量检测.结果慢性病毒携带、慢性活动性肝炎患者CD8淋巴细胞与正常对照比较均无明显差别.慢性活动性肝炎组CD3+CD8+/CD45R0+淋巴细胞百分率为(15.7±3.35)%,明显高于正常对照(P＜0.05),其CD3+CD8+/CD45RA+淋巴细胞百分率为(12.3±4.39)%,明显低于正常对照(P＜0.05).慢性活动性肝炎组CD3+CD8+CD28+细胞百分率为(23.7±3.35)%,明显高于正常对照(P＜0.05),而慢性病毒携带组CD3+CD8+CD28-细胞百分率为(16.3±4.37)%,明显高于正常对照(P＜0.05).高病毒载量与低病毒载量患者的CD3+CD8+/CD45R0+亚型、CD3+CD8+/CD45RA+亚型均无明显差别,CD3+CD8+CD28+亚型和CD3+CD8+CD28-亚型亦无明显差别.结论慢性乙型肝炎患者病情的进展与CD8淋巴细胞总量无关;可能是由于机体免疫功能增强,CD3+CD8+CD45RO+亚型、CD3+CD8+CD28+亚型淋巴细胞数升高,诱发细胞毒性淋巴细胞(CTL)作用的结果.但血清中病毒载量的变化与外周血中CD8淋巴细胞亚型无明显相关性。

目的 探讨失代偿性肝硬化并发肝肾综合征(HRS)与血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多态性之间的关系.方法应用聚合酶链反应方法扩增76例失代偿性肝硬化并HRS患者及各对照组患者的ACE基因上的DNA片段,根据L/D来判断其多态性,同时各例均采血测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)等指标,并测肾小球滤过率(GFR),比较不同基因型间这些指标的差异有无显著意义.结果HRS患者各基因型及等位基因频率与各对照组间差异均无显著意义(P均＞0.05);除其他肝病组外,各组Ⅰ等位基因频率均显著高于D等位基因频率(P均＜0.01),而各对照组中,3种基因型频率间差异无显著意义(P＞0.05),HRS组中,Ⅱ基因型频率显著高于ID及DD型(P＜0.05).Ⅱ基因型的BUN与SCr均显著高于ID型及DD型(P均＜0.05),GFR显著低于ID型及DD型(P＜0.05).结论ACE基因Ⅱ型可能为失代偿性肝硬化易并发HRS的遗传学方面因素。

目的 建立一种新的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)反应模式,以提高传染性非典型肺炎(SARS)冠状病毒检测的阳性率和研究病毒在机体的定位状态和致病机理.方法采用两种RT-PCR反应模式检测SARS患者血浆、淋巴细胞、粪便以及肺组织中病毒核酸.结果和常规PCR方法相比,新的PCR反应模式能显著提高标本中病毒的检出率,差别有统计学意义;急性期SARS患者淋巴细胞中病毒阳性率较高(84.6%);血浆中病毒阳性率较低(11.5%).结论新RT-PCR反应模式可能有利于早期诊断、筛检SARS病原体;淋巴细胞中病毒的检出率较高,提示此类标本可用于SARS实验室诊断,对分析和阐明SARS的发病机制亦可能有一定的指导作用。

快速、经济地从外周血或组织中提取高产量、高纯度的DNA,对于疾病的分子水平研究非常重要.目前基因组DNA的提取方法较多,如酚/氯仿、尿素提取法、氯化锌法[1]、三乙醇月桂基硫酸盐(TLS)法、碘化物法[2]、直接煮沸法等等,但也都有其不足之处.通过长期试验,我们建立了一种采用氯化钠高盐沉淀法提取外周血基因组DNA的方法,并与其他几种方法做了比较研究。

载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)是血浆主要载脂蛋白之一,具有明显的遗传多态性,3种常见的等位基因(ε2、ε3、ε4)分别编码3种主要异构体(E2、E3、E4),产生6种不同的基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4).apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素,而且与Alzheimer病密切相关.目前国内外检测apoE基因多态性的方法很多,因而快速简便的检测方法也就成为研究中关注的焦点.等位基因特异性多重聚合酶链反应(PCR)技术(multi-ARMS)是利用TaqDNA聚合酶对引物3′端核苷酸的特异性,在不同的反应体系中分别加入与待检测位点野生型、突变体相配的一对引物,通过扩增产物的有无来判定该位点是否突变。

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A) 基因并进行原核表达.方法采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成cDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白.包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析.结果重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性.结论作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。

目的 研究肺炎链球菌是否可触发肺Ⅱ型上皮细胞(A549)微丝肌动蛋白F-actin重排,进而导致对A549细胞的侵袭及其与磷脂酶C信号转导分子的关系.方法采用F-actin特异性FITC-phalloidin荧光染料,观察肺炎链球菌作用A549细胞前后的F-actin细胞骨架重排情况,依照重排百分率得分标准以(%)表示;用F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D预处理A549细胞,观察肺炎链球菌对A549细胞的侵袭数;使用PLC信号转导分子抑制剂U73122预处理A549细胞,观察其与F-actin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系.结果肺炎链球菌作用A549细胞后,经FITC-phalloidin荧光染色,F-actin细胞骨架呈亮黄色圆形聚集;F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D可明显降低肺炎链球菌对A549细胞的侵袭,在其浓度为0.25μg/ml时,未得到可测的细菌数;PLC信号转导分子抑制剂U73122可部分抑制A549细胞F-actin细胞骨架重排,并与F-actin细胞骨架重排百分率间存在量效关系,其相关系数为rPLC=-0.98(P＜0.05).结论肺炎链球菌可通过激活A549细胞PLC信号转导分子而触发A549细胞F-actin细胞骨架重排,而侵袭A549细胞。

目的 通过检测产志贺毒素大肠埃希菌中的志贺样毒素,确定网状分枝扩增技术的灵敏度和特异性,从而进一步探讨该方法用于检测食品和临床标本中O157:H7和STEC的可行性.方法用网状分枝扩增技术检测合成的志贺样毒素2的基因和临床分离的菌株,确定该方法的灵敏度和特异性,与聚合酶链反应进行比较.结果网状分枝扩增技术最少能检测10个志贺样毒素DNA分子,与PCR灵敏度一样.E.coliO157:H7和志贺痢疾杆菌志贺样毒素阳性,而非致病性大肠埃希菌为阴性.用网状分枝扩增技术与PCR对分离的菌株进行检测,结果也一致.结论网状分枝扩增技术具有高度的灵敏度和特异性,操作简便,而且在等温条件下扩增核酸,因此可替代PCR检测食品和临床标本中的产志贺样毒素大肠埃希菌。

患者,男,37岁,2003年8月15日因开放性颅脑损伤,失血性休克入我院治疗,入院后急诊行开颅手术及气管切开术,术后患者持续昏迷,体温一直正常,曾发生脑脊液鼻漏,9月22日在一次呛咳、呕吐后突然出现高热,体温达38～40.5℃.腰穿脑脊液呈乳白色、混浊、无凝块,潘氏试验++,蛋白定量958 mg/L,单核细胞0.16,多核细胞:0.84;血WBC11.2×109/L、N 0.80、L 0.13、M 0.05、E 0.02,脑脊液细菌培养两次(间隔2 d)均为化脓放线菌,经选择氯霉素、阿米卡星、氧氟沙星联合用药,于第二天患者体温恢复正常,第四天脑脊液清亮,细菌培养无菌生长,常规各项指标逐渐恢复正常。

研究基因与蛋白质间的相互关系,是现代分子生物学研究的重要课题之一.近年来,现代分子生物学认为细胞中生物信息的表达受两种因素调控:一种是遗传调控,另一种是表观遗传调控。

随着基础医学、临床医学、生物医学和信息技术的飞速发展,我国的临床检验医学发生了翻天覆地的变化,正进入一个全新的高速发展时期.先进实验技术和现代化仪器的广泛应用,使检验医学在临床诊治疾病中发挥着越来越重要的作用.检验医学已逐步成为我国临床医学中不可缺少的一部分[1].面对临床医学全科医师的建立和发展壮大,促使检验医学专业人员在全面掌握检验与临床医学基础知识方面不断努力,以便加强检验医学与临床各专业的合作,促进其共同发展。

近年来,有关端粒和端粒酶的研究异常活跃.随端粒酶结构、功能及调控的深入研究,人们对端粒酶在细胞永生化及癌变中的作用有了新的认识.端粒酶检测技术对恶性肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗监测具有重要的临床意义。

王金良教授是天津市公安医院检验科主任，主任技师；天津医科大学检验系教授，是我国著名临床微生物学和实验诊断学专家。曾任中华医学会检验分会2～4届常委，第4届副主任委员，现任顾问。《中华检验医学杂志》第2～4届编辑委员会委员。中华医学会天津分学检验专业委员会3、4届主任委员，现任名誉主委。1992年国务院授衔专家。1997年国务院授予一级技术警监。

目的 鉴定中国人群的ABO血型新等位基因.方法 ABO血清学定型、PCR-SSP基因定型、基因克隆和测序分析.结果一个血型血清学为A2亚型、PCR-SSP基因定型为A2O1的健康捐血者,其O1基因单倍体的2个碱基发生了缺失突变,即第6外显子区域中261位G缺失和第7外显子区域中496位A缺失.该等位基因与ABO*O101基因序列的差异在于496位A缺失.结论该等位基因是一个与O1基因相关的新变异等位基因,GenBank的注册号为AY374123。

目的 探讨特殊血友病A(HA)家系的基因诊断.方法用内含子22倒位检测及 FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析;用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测.结果家系1先证者表型为重型HA,FⅧ内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析未获得诊断信息;直接核酸测序证实先证者及其妹FⅧ基因24号外显子第2209位氨基酸存在R2209Q错义突变,后者胎儿DNA检测为正常男性.家系2中HA先证者已去世,一名要求做携带者检测的女性表型正常,内含子22倒位检测及直接核酸测序没有发现基因缺陷,用 FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均显示该成员未携带血友病A基因.结论联合应用直接核酸测序法及多态性遗传连锁分析可以对特殊血友病A家系进行基因诊断。

目的 探讨和比较不同病理状态下实体肿瘤患者血清血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)活性及可溶性尿激酶受体(suPAR)水平和胸腺肽α1(Tα1)水平的改变的意义.方法以残余胶原结合力(R-CBA)检测血清vWF-cp活性水平、免疫放射分析测定suPAR水平及酶联免疫吸附试验检测Tα1水平.比较不同病理状态下84例恶性肿瘤患者血清vWF-cp活性水平,以及vWF-cp活性水平与suPAR和Tα1水平预示恶性肿瘤存在的敏感性和特异性.结果 (1)vWF-cp活性水平在恶性肿瘤患者中显著降低,而suPAR和Tα1水平则显著增高.伴有远处转移的恶性肿瘤患者vWF-cp活性更低,下降至55.8%±16.2%(P<0.05).而suPAR水平则在局部淋巴结浸润和远处转移的患者中均增高(P<0.05和0.01).(2)在恶性肿瘤患者中,Tα1与suPAR水平是较敏感的指标,而vWF-cp则是一个较特异的指标.vWF-cp活性水平与suPAR水平存在较好的相关性(r=0.39,P<0.001),但和Tα1无相关性.结论 vWF-cp活性、suPAR水平和Tα1水平在恶性肿瘤患者血清中显著改变,但三者变化的程度不同.联合检测三者的水平有助于判断肿瘤的良恶性以及了解患者的病情发展。

目的 探讨遗传性高铁血红蛋白血症的分子诊断方法.方法采用RT-PCR和PCR产物直接测序法,对3例遗传性高铁血红蛋白血症患者细胞色素b5还原酶(b5R)cDNA编码区序列进行分析.通过基因组DNA的PCR-限制性酶切或PCR-序列测定,验证cDNA策略所检出的突变.结果患者A的b5R cDNA在第527位碱基呈T/C杂合状态,第608位碱基呈G/A杂合状态;患者B的b5R cDNA在第170位碱基和第179位碱基均呈G/A杂合状态;患者C的b5R cDNA在第608位碱基呈G/A杂合状态,第791位碱基呈C/T杂合状态.基因组DNA策略与cDNA策略所得结果一致.结论建立了遗传性高铁血红蛋白血症的分子诊断方法,并在3例患者中发现了3个以复合杂合子形式存在的、新的b5R基因突变。

急性髓系微分化型白血病(AML-M0)在AML中占不到5%的病例,本组研究占所有AML的3.75%.这种低分化细胞形态学的不均一性,使单纯形态学诊断分型时系列归属困难,加之所有细胞化学染色95%为阴性,故亚型不易确定.自1999年开始,我们采用细胞化学染色、免疫分型并结合基因分型对10例AML-M0进行诊断,同时与其他AML亚型(除外M3)的214例患者进行比较。

人类基因组计划完成之后,人类基因组外遗传计划正式启动.DNA甲基化是其中一个为人熟知的基因外遗传信号.研究发现,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生有关.在肿瘤发生的早期已发现许多基因启动子的甲基化状态发生改变.因此,DNA甲基化测定有可能成为一个新的肿瘤分子标志物.因而,建立一种快速、准确的检测DNA甲基化的方法非常必要。

大量输血是临床抢救严重创伤性失血、消化道出血、产后大出血和开展较大的疑难复杂手术的根本保证,但输入大量库存血不仅不能改善受血者凝血功能甚至会引起患者凝血功能异常[1,2].为了有效地控制出血,在抢救大出血患者输血时,往往需要同时输入血小板及补充其他凝血因子.为此我们采用机采血小板与冷沉淀联合输注。