2004年 · 第27卷第05期

21世纪是生命科学的世纪,也是一个信息爆炸的时代.2002年6月26日首张人类基因图和测序计划(HGP)完成后;科学家们开始进入功能基因组,即"后基因时代"的研究.随蛋白组学研究与疾病相关基因和功能蛋白不断发现,出现了大量的生物信息和需要解决的医学问题.随之,现代生物技术,转入基因组学技术、蛋白组学技术、生物信息学、生物芯片技术、基因克隆、重组、表达技术,动物体细胞克隆技术等方面,其中引人关注的是生物芯片技术.生物芯片技术始于20世纪80年代后期,被评为1998年度世界十大科技进展之一,其概念源于计算机芯片.其成熟标志为全球掀起至今方兴未艾的技术研究和产业化生产的热潮。

目的 建立连接酶链反应-酶联免疫吸附试验(LCR-ELISA)检测沙眼衣原体DNA的方法,并初步应用于检测新生儿沙眼衣原体感染.方法针对沙眼衣原体外膜蛋白基因设计4条引物,并分别在其两端标记地高辛和生物素.用此4条引物进行LCR扩增沙眼衣原体DNA.带有生物素和地高辛双标记的扩增产物以ELISA方法显色判断结果.采集328份肺炎新生儿鼻咽标本,分别对其进行培养和LCR扩增,应用ELISA检测有无沙眼衣原体感染.结果LCR-ELISA方法可以检测出6种沙眼衣原体标准株,而对2种肺炎衣原体和其他细菌DNA无反应,显示出较强的特异性;可检测出10fg的DNA,较传统电泳法敏感10倍,且避免了溴化乙啶的污染.328份标本中,LCR-ELISA检测出68份阳性,培养仅检测出60份,两者相比差异有显著性.以扩大的金标准判断,LCR-ELISA的特异性、敏感性分别为100%和98.6%;而培养的特异性、敏感性分别为100%和、86.9%.结论LCR-ELISA是一种特异而敏感的基因扩增方法,避免了溴化乙啶污染,判断结果客观,检测方便.经临床初步应用,取得良好结果,值得进一步研究和完善。

目的 研究建立人B细胞激活因子(BlyS)mRNA荧光定量检测方法,探讨正常人外周血单个核细胞(PBMC)中BlyS基因表达水平.方法基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-BlyS作为定量模板,在GeneAmp 5700型检测仪上,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法;并对20名健康献血者外周血中BlyS表达进行检测.结果FQ-RT-PCR的动态检测范围为104～109拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参三磷酸甘油醛脱氢酶的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA(r≥0.998);低值的批内、批间的重复性分别为17.7%和24.3%,高值的批内、批间的重复性分别为5.3%和8.1%;20名献血员健康外周血的PBMC中均有BlyS mRNA的表达,范围为5.5×104～4.9×105拷贝/μg,均值为(1.7±1.4)×105拷贝/μg.结论成功建立人BlyS基因表达FQ-PCR检测方法,检测结果定量准确可靠,可用于BlyS基因表达与自身免疫性疾病发病机制的关系研究。

目的 探讨内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因内含子4的多态性与糖尿病肾病的关系,以及其在中国人、马来西亚人和印度人中的分布.方法选择258例病程在10年以上的2型糖尿病患者作为观察对象,其中中国人150例、马来西亚人71例、印度人37例.从患者全血中提取DNA,然后,进行聚酶链反应(PCR)、克隆及测序.结果以往认为该基因有2种等位基因(a和b),而本研究发现3种等位基因,并对第3种多态(等位基因c)基因进行了序列分析;统计分析显示,等位基因a、b和c均与糖尿病肾病无显著相关性.结论eNOS基因内含子4上的多态性有3种等位基因;该基因多态性与糖尿病肾病无显著相关性。

目的 检测结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因启动子区异常甲基化改变及蛋白表达情况,探讨其与结直肠癌发生发展与临床的关系.方法采用甲基化特异PCR(MSP)和免疫组织化学链霉素过氧化物酶(SP)方法,对32份结直肠癌标本p16基因甲基化改变及蛋白表达情况进行检测分析.结果p16甲基化阳性率为40.6%;p16蛋白表达阳性率75.0%;在病理分期中,DukesC、D期患者肿瘤组织中p16甲基化发生率63.0%,p16蛋白表达发生率为69.0%;DukesA、B期患者p16甲基化发生率为25.0%,p16蛋白表达阳性率为81.0%;在组织分化程度中,低分化癌中的p16甲基化阳性率为100.0%,p16蛋白表达阳性率为20.0%;在高、中分化癌中,p16甲基化的阳性率为30.0%,p16蛋白表达阳性率为85.0%;淋巴结转移癌患者肿瘤组织中p16基因甲基化阳性率为63.0%,淋巴结未转移的阳性率为25.0%;在肿瘤部位中,直肠癌p16蛋白表达阳性率为65.0%,结肠癌的阳性率为100.0%.结论p16甲基化的改变可能影响p16蛋白的表达;p16甲基化、蛋白表达与结直肠癌的发生发展密切相关,p16甲基化和蛋白表达是结直肠癌患者诊断及预后的候选标志物之一。

目的 研究中国汉族人群中血清E-选择素水平,及其基因第2外显子G98T和第4外显子S128R多态性与急性心肌梗死(AMI)的相关性.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,检测185例急性心肌梗死患者和190名健康对照者E-选择素基因多态性,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA),检测急性心肌梗死患者和对照者血清E-选择素水平.结果急性心肌梗死组E-选择素水平显著高于对照组(P＜0.01),E-选择素基因S128R基因型频率和等位基因频率,急性心肌梗死组和对照组比较差异有显著意义(P＜0.05),基因型频率的相对风险分析发现,SR基因型携带者患急性心肌梗死的风险,是SS基因型的2.226倍(比值比=2.226,95%可信区间:1.106～4.481),SR基因型携带者的E-选择素血清水平显著高于SS基因型[(41.93±8.94)μg/L和(35.75±6.83)μg/L,P＜0.05].E-选择素G98T各基因型分布在急性心肌梗死组和对照组之间比较差异无显著意义(P＞0.05).结论E-选择素S128R基因多态性与急性心肌梗死的发病有关联,并可影响血清E-选择素水平,R等位基因可能是急性心肌梗死发病的遗传易感基因;E-选择素基因G98T多态性在急性心肌梗死发病中可能不起重要作用。

目的 探讨血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)和血清白细胞介素6(IL-6)在糖尿病并发动脉粥样硬化的临床价值.方法用岛津7200生化分析仪胶乳增强免疫比浊法检测血清hs-CRP,一步法检测低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);采用ELISA双抗体夹心法测定血清IL-6.结果糖尿病患者LDL-C升高组,血清hs-CRP浓度为(6.81±3.32)mg/L,IL-6为(17.2±5.6)ng/L,两者呈显著正相关,r=0.61;P＜0.01.糖尿病患者LDL-C正常组hs-CRP为(3.81±1.86)mg/L,IL-6为(9.2±3.9)ng/L,呈明显正相关,r=0.46,P＜0.01.健康组血清hs-CRP为(0.76±0.65)mg/L,血清IL-6为(5.8±2.1)ng/L,r=0.136,两者无明显相关性(P＞0.05).结论糖尿病患者血清IL-6参与诱导肝急性时相蛋白(CRP)的合成,并共同参与糖尿病动脉粥样硬化的病理过程。

目的 建立一种利用重组表达的丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位(PDC-E2)和E3结合蛋白(PDC-E3BP)检测原发性胆汁肝硬变(PBC)患者血清的方法.方法以适当的条件诱导PDC-E2和PDC-E3BP表达质粒pExSecI/PDC-E2和pET28/E3BP,利用表达产物通过酶联免疫吸附试验检测PBC、正常人及其他原因肝硬变患者血清,并与欧盟的检测试剂盒比较.结果显示PDC-E2和PDC-E3BP表达产物检测PBC患者血清中的自身抗体阳性率为93.3%,与欧盟试剂盒比较,总符合率为98.03%.结论建立了利用重组表达丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位和E3结合蛋白检测PBC患者血清中自身抗体的方法,且获得PDC-E2和PDC-E3BP的高效表达产物。

幽门螺旋杆菌(HP)呈全球性分布,多数地区感染率在50%以上,我国感染率在50%～80%[1].由于HP菌株不同,其所含细胞毒素相关蛋白CagA、VacA及其他致病因子也不尽相同,因此临床表现也各异.本研究利用蛋白芯片技术检测几类消化道疾病患者血清中HP的5种抗体,试图阐明它们与各类消化道疾病的关系。

目的 探讨乙型病毒性肝炎患者凝血酶原时间(PT)的标准化报告方式.方法选择乙型病毒性肝炎患者61例,其中肝炎后肝硬化41例,慢性重型肝炎20例.20例口服华法令抗凝药患者作为对照组.采用来源不同、ISI值不同的6种凝血活酶试剂进行PT测定,以秒数、比率、活动度百分率以及国际正常化比率4种方式表示PT结果.结果病毒性肝炎患者PT结果,当以活动度百分率和比率形式表示时,不同凝血活酶试剂之间差异没有显著性意义(F=1.289,P=0.268;F=1.992,P=0.079),当以秒数和INR报告方式表示时,差异有显著意义(F=8.491,P=0.0001;F=2.497,P=0.031).通过Neoplastin与其他5种试剂的PT结果作线性回归分析,当结果以活动度百分率表示时,Neoplastin与其他5种试剂之间存在高度一致性;而以秒数,比率和INR表示时,试剂之间不存在一致性.提示PT活动度百分率能使乙型病毒性肝炎中末期患者PT报告方式标准化.口服抗凝剂治疗的患者仅INR能使PT的报告方式标准化.结论PT活动度百分率能使乙型病毒性肝炎中末期患者PT报告方式标准化,INR仅适用于抗凝治疗患者PT结果的报告。

目的 观察反义寡核苷酸封闭鼠淋巴细胞H-2Kd基因后,对其表达的影响及淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性改变,探讨淋巴细胞Ⅰ类主要组织相容性抗原(MHC-Ⅰ)在肿瘤免疫中的作用.方法将人工合成的H-2Kd起始区反义寡核苷酸作用于小鼠脾LAK,流式细胞仪检测作用前后H-2Kd的表达率.噻唑蓝法检测H-2Kd表达降低的LAK对肿瘤杀伤活性.结果反义寡核苷酸(15μmol/l)组H-2Kd蛋白的表达率由90.1%±4.4%下降至79.8%±2.5%(P＜0.01),H-2Kd降低的LAK杀伤活性明显降低,对K562的杀伤活性由82.3%±3.1%降到60.2%±6.7%(P＜0.01),对H22细胞株的杀伤活性由67.4%±2.8%降到53.2%±8.1%(P＜0.01).结论反义寡核苷酸能够抑制小鼠LAK表面H-2Kd的表达,但不影响LAK增殖活性,因而可导致鼠LAK对同种及异种肿瘤细胞的杀伤活性降低。

电阻抗法血细胞分析仪检测血标本时,除给出细胞数外,还提供相应的细胞体积分布直方图.它以细胞体积为横坐标,细胞的相对数量为纵坐标,表示某一种细胞数量分布情况,可反映细胞体积大小异质性.包括白细胞、红细胞和血小板三种直方图.下面接着介绍红细胞和血小板两种直方图的特点及临床意义。

2003年8月,我们从一例间断发热患者的血液中两次血培养分离出放射形土壤杆菌,该菌从血液中分离实属少见。

在全球,金黄色葡萄球菌(金葡)是社区及医院感染的主要病原菌.一种新型抗生素的应用往往会带来相应抗生素的耐药.自从发现青霉素能有效治疗金葡所致感染并应用于临床之后,50年代便出现了耐青霉素的金葡;耐酶青霉素的大量应用导致80年代耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现;糖肽类抗生素是治疗MRSA感染非常有效的一类抗生素,以万古霉素(万古)作为MRSA的经验治疗导致90年代VISA(对万古中介耐药的金黄色葡萄球菌)及2002年的VRSA(对万古耐药的金黄色葡萄球菌)的出现.目前为止,世界上已报道多例VISA感染及2例VRSA感染的病例[,2].因此,为了使临床医生能更好的治疗VISA及VRSA引起的感染,笔者将从VRSA的耐药机制、实验室检测及治疗和预防原则等方面的研究进展作一综述。

1.如果葡萄球菌对庆大霉素耐药,则该菌同时对除外链霉素以外的氨基糖苷类抗生素耐药。

孔宪涛教授是我国著名实验诊断学和临床免疫学专家,第二军医大学硕士研究生导师和博士研究生导师.曾任<中华检验医学杂志>第五届编辑委员会副总编辑,全军临床免疫中心主任,第二军医大学长征医院实验诊断科主任、实验诊断教研室主任、教授.并曾任全军科学技术委员会委员、全军检验医学专业委员会主任委员、中华医学会检验医学分会副主任委员、中国免疫学会副理事长、临床免疫专业委员会主任委员.还曾任中华医学会第20、21届理事、上海免疫学会理事长、自然科学基金第四届、五届评审委员、上海市第七、八届政协委员、上海检验学会主任委员和上海市高级职称评委会委员等近30余项社会职务.获得突出贡献中青年专家称号和国务院政府特殊津贴享受者,1990年获全国优秀教师、1989年获全军优秀科技工作者、1992年获解放军总后勤部优秀党员、1995年获全军伯乐奖等称号。

目的 研究传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS),探讨患者在不同发病阶段血清中多种细胞因子的变化、发病机理及与免疫反应的关系.方法应用Randox公司产生的EVIDENCEl80全自动化学发光生物芯片分析仪,对90名健康成年人和34例确诊SARS患者的早、中、晚3期血液标本分别进行了12项细胞因子的定量检测,以比较不同发病阶段各种细胞因子的变化趋势.结果SARS患者血清中的细胞因子水平除IL-1β没有显著变化外,其他各项变化均比较明显.其中,IL-6、IL-8、IL-10及干扰素γ与健康人比较显著上升;而IL-1α、IL-2、IL-4、血管内皮生长因子、表皮生长因子、单核细胞趋化蛋白-1及肿瘤坏死因子α与健康对照组比较显著下降.结论各种血清细胞因子在SARS患者不同发病时期有较大变化,发病早期尤为明显,本结果进一步支持SARS患者的病理损伤过程与免疫失调有关。

目的 探讨传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS),冠状病毒(SARSCoV)抗体在SARS病原学诊断中的特异性及其在系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、干燥综合征(SS)和混合结缔组织病(MCTD)患者中的假阳性问题.方法应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量RT-PCR技术检测了111名正常对照和58例SLE、20例RA、10例SS、16例MCTD患者做血清中SARS-CoV抗体的检测.结果在111名正常对照中,IgM抗体均阴性,IgG抗体的阳性率为3.6%;IgG抗体诊断SARS的特异性为96.4%,两种抗体同时阳性诊断SARS的特异性为100%.58例SLE患者中,IgM抗体和IgG抗体阳性率分别为8.6%和32.8%,IgG抗体和IgM抗体同时阳性为19%;在10例SS患者中只有1例两种抗体同时阳性(10%);在16例MCTD患者中,IgG抗体阳性6例(37.5%),两种抗体同时阳性1例(6.3%);在20例RA患者中只有1例IgG抗体阳性(5%).经RT-PCR检测,上述自身免疫病患者中的阳性病例血清SARS-CoV抗体均为阴性.结论用非纯化抗原制备的ELISA试剂盒测定自身免疫病患者的SARS-CoV抗体,可能出现假阳性,两种抗体同时测定可降低诊断的假阳性率,提高诊断的特异性.在自身免疫病患者中出现假阳性的原因可能与包被的抗原有关。

目的 初步研究建立磁捕法对传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒RNA的富集、纯化体系,以提高逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS冠状病毒RNA的敏感性.方法根据国际基因库公布的SARS冠状病毒基因序列,自行设计引物、探针,体外克隆目的RNA片段作为标准物质;利用标准RNA以及模拟SARS血清标本的RNA,评价自行设计的SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系和磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的检测效果.结果SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系,对于模拟血清SARS标本RNA的最低检测样本浓度为20拷贝/μl,而磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的最低检测样本浓度为1拷贝/μl.结论初步建立的磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系,可有效地对低浓度的RNA样本进行浓缩、纯化,有效提高SARS RT-PCR检测方法的敏感性。

目的 探讨传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)患者急性期血清特种蛋白的变化规律及其临床意义.方法SARS急性期组:本院临床诊断为SARS,发病后5 d内患者42例.正常对照组:体检健康成年人30名.采用速率散射比浊法检测血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3(C3)、补体C4(C4)、C反应蛋白(CRP)、a1酸性糖蛋白(a1-AG)、a1抗胰蛋白酶(a1-AT)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)的浓度.结果与正常对照组相比,急性时相反应蛋白中CRP、a1-AG、a1-AT明显升高(P＜0.01);TRF明显降低(P＜0.01);CER略有降低,但无统计学意义(P＞0.05);补体中C3水平降低(P＜0.01);C4水平升高(P＜0.01).免疫球蛋白中IgG、IgM、IgM皆无显著性差异(P＞0.05).结论SARS急性期患者血清中特种蛋白的浓度变化有一定的规律.在SARS急性期联合检测CRP、a1-AG、TRF,对急性期SARS患者炎症的严重程度的判断有一定的参考价值。

我们调查了传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)住院患者血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)水平,对SARS患者的不同病程分析讨论。

为了解传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)患者血细胞变化是否不同于其他病毒性肺炎,掌握SARS患者血象变化规律,我们回顾性分析了我院收治的103例SARS患者的血细胞变化。

我国临床生化领域的开拓者、检验医学界前辈、中华检验医学杂志编辑委员会第1～5届副总编辑、卫生部北京老年医学研究所李健斋教授，于2004年4月9日因病在京逝世，享年82岁。