2019年 · 第42卷第02期

高通量测序又称下一代测序（NGS），是一种新型的遗传学筛查和诊断技术，它的不断革新加速了人们对遗传学标志物及疾病分子机制的认识，特别是针对复杂遗传性疾病。NGS技术的发展，特别是靶向基因组测序、全基因组外显子组测序以及全基因组测序项目的出现，NGS在临床已经应用到检测单核苷酸变性以及结构重排和拷贝数变异，监测循环肿瘤DNA，并分析先前对标准生物信息学算法进行管理所挑战的基因组区域等。

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居癌症之首。肺癌与其他肿瘤一样，在肿瘤的发生发展过程中存在异质性。对异质性的全面了解才能实现真正意义上的个体化治疗，这也是精准医疗的精髓。近年来，新一代测序技术依托其高通量、多靶点分析的优势为精准医疗提供了新的重要技术手段，在肺癌的分子分型、靶向药物选择及预后判断中发挥着越来越重要的作用。

智力障碍是一组常见的神经发育障碍性疾病，基因型和表型的异质性都很高，对其的明确诊断越来越依赖全基因组范围内的分子诊断。基于高通量测序（NGS）的panel测序，全外显组测序甚至全基因组测序在智障的分子诊断上都有很好的应用，推荐家系全外显组测序，特别是家系全外作为首选检测方法。针对智障的的NGS数据分析以及重分析对诊断有临床意义，可以可靠检测出基因组内的小尺度突变及拷贝数变异。因此有可能会成为下一个推荐的智障分子诊断技术。

串联质谱（TMS）技术已用于新生儿氨基酸代谢障碍、有机酸血症及脂肪酸氧化代谢障碍等遗传代谢病筛查，但各实验室技术参差不齐，缺乏统一标准。为了规范我国TMS新生儿筛查实验室与技术各环节，卫生部临床检验中心新生儿疾病筛查室间质评委员会组织专家，制定新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识，用以促进TMS技术在我国新筛中标准化和规范应用，提升技术水平与实验室能力。

目的 探讨微小RNA-25（miR-25）在三阴乳腺癌患者血浆、组织和细胞系中的表达情况及其对三阴乳腺癌侵袭转移影响的潜在分子机制。 方法 横断面研究。运用实时荧光定量PCR检测86例三阴乳腺癌患者和38名正常对照者血浆中miR-25的水平；应用LinkedOmics网站分析平台分析三阴乳腺癌与非三阴乳腺癌样本中miR-25的水平；同时用定量PCR检测三阴乳腺癌细胞系中miR-25的表达情况；运用划痕和Transwell实验检测miR-25抑制剂或对照转染后，三阴乳腺癌细胞系迁移和侵袭能力的变化；应用荧光素酶报告基因技术验证1-磷酸鞘氨醇磷酸化酶SGPP1是否为miR-25的靶基因；采用SGPP1过表达质粒和miR-25过表达质粒共同转染MDA-MB-231细胞，运用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移和侵袭能力的影响；免疫印迹Western blot检测SGPP1蛋白水平的变化。正态分布的组间样本均数比较用Student′s t检验。 结果 86例三阴乳腺癌患者血浆中miR-25的水平明显高于正常对照组（P为0.031）；LinkedOmics网站分析平台分析显示，三阴乳腺癌标本中的miR-25表达水平明显高于常见的非三阴乳腺癌Luminal A型和Luminal B型（P分别为<0.001和0.006）；在三阴乳腺癌细胞系HS578T、HCC1806、MDA-MB-231和BT549中miR-25的表达均明显高于乳腺上皮细胞系HBL-100（P分别为0.006、0.01、0.029和0.046）；划痕实验显示，在MDA-MB-231和HS578T细胞中转染miR-25抑制剂后，较对照组相比，伤痕愈合率受到明显抑制（P分别为0.035和0.001）；Transwell实验表明，转染miR-25抑制剂的MDA-MB-231和HS578T的细胞侵袭能力明显低于阴性对照组（P分别为0.002和0.001）；LinkedOmics平台分析显示，三阴乳腺癌患者癌组织中miR-25与SGPP1表达呈负相关（P为0.037）；双荧光素酶报告基因证实，SGPP1是miR-25的直接靶基因；抑制miR-25能增加SGPP1的蛋白水平；共转染SGPP1过表达质粒和miR-25过表达质粒能明显削弱miR-25过表达引起的细胞迁移和侵袭能力的促进作用（P均为0.002）。 结论 miR-25在三阴乳腺癌患者血浆、组织和细胞系中均高表达；抑制miR-25能明显抑制三阴乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力；miR-25可通过靶向SGPP1参与到其对三阴乳腺癌迁移和侵袭的调控中。

目的 探讨无创产前基因检测（NIPT）在胎儿染色体非整倍体疾病（T21、T18及T13）一线筛查中的应用价值。 方法 回顾性分析2017年5月至2018年6月复旦大学附属妇产科医院行NIPT检测孕妇8 517例，除14例检测失败外，其余孕妇根据是否做唐氏筛查分为唐氏筛查联合NIPT检测组2 996例和单纯NIPT检测组5 507例。对NIPT高风险病例进行介入性产前诊断，随访妊娠结局，采用Fisher′s精确检验比较检验效能。 结果 8 517例孕妇中，14例（0.16%）孕妇NIPT检测失败；83例提示染色体异常，检出率0.98%（83/8 503），包括29例T21、14例T18、6例T13和34例性染色体异常。唐氏筛查联合NIPT检测组共2 996例，其中NIPT高风险14例，性染色体异常12例，产前诊断分别确诊11例、3例；单纯NIPT检测组5 507例，NIPT高风险35例，性染色体异常22例，产前诊断确诊29例、11例。唐氏筛查联合NIPT检测组与单纯NIPT检测组相比，NIPT检测对常见染色体非整倍体的筛查效能差异无统计学意义（P=1.00），敏感度分别为11/11、29/29，特异度为99.90%（2 982/2 985）、99.89%（5 472/5 478），阳性预测值（PPV）为78.57%（11/14）、82.86%（29/35），阴性预测值（NPV）为100%（2 982/2 982）、100%（5 472/5 472）。此外，NIPT检测对性染色体异常的敏感度、PPV接近100%、41.18%。随访未发现假阴性病例。 结论 本研究中直接选择NIPT检测孕妇比例约64.77%（5 507/8 503）。NIPT检测常见染色体非整倍体的筛查效能（特异度、PPV等）显著高于唐氏筛查，对性染色体异常也有一定的检出率，显著降低侵入性诊断比例。NIPT检测作为一线产前筛查具有一定临床意义，但对于NIPT高风险孕妇仍需侵入性诊断。

目的 采用改进的实验方法研究血管紧张素转换酶（ACE）基因rs1799752多态性与2型糖尿病（T2DM）肾病（DKD）的相关性，并探讨该多态性与环境因素（吸烟、肥胖）的交互作用对DKD的影响。 方法 病例对照研究。选择2016年6月至2018年3月中日友好医院收治的T2DM合并DKD患者[DKD（+）组]和T2DM不伴DKD患者[DKD（-）组]各300例为研究对象。采用改进的PCR-毛细管电泳法进行基因分型。统计学分析两组受试者的临床生化指标和ACE基因I/D多态性不同基因型及等位基因频率，进一步按吸烟、肥胖状况分组进行多因素回归分析。 结果 DKD（+）组患者DD基因型及D等位基因频率均高于DKD（-）组[DD基因型：15.0%（45例）比7.3%（22例），χ2=10.8，P=0.004；D等位基因频率：36.5%（219例）比28.0%（168例），χ2=9.92，P=0.02]。多因素Logistic回归分析显示，在隐性和加性遗传模型中，D等位基因与DKD发病风险显著相关（校正后，隐性模型：OR=1.45，95%CI：1.06~2.00，P=0.022；加性模型：OR=1.41，95%CI：1.04~1.90，P=0.025）。在吸烟组和肥胖组，D等位基因在显性和隐性模型中与DKD的发病显著相关（校正后均P<0.05），表明吸烟组和肥胖组的D等位基因携带者有更高的DKD发病风险。而在非吸烟组和非肥胖组，未校正和校正后的3种模型中均未发现基因型及等位基因与DKD相关（均P>0.05）。 结论 ACE基因I/D多态性与2型糖尿病患者DKD的发病相关，D等位基因是DKD发病的易感基因，DD基因型是2型糖尿病合并DKD的危险因素。ACE基因I/D多态性可能与吸烟、肥胖环境因素协同促进DKD的发病。

目的 探讨多重荧光聚合酶链式反应（PCR）检测在临床血流感染诊断中的应用价值。 方法 利用前瞻性研究方法，对收集2018年1月至5月期间宁波市鄞州人民医院检验科微生物室检测的256份血培养物，用多重荧光PCR法进行各病原体基因检测，将PCR法结果与传统血培养细菌鉴定仪鉴定（传统血培养法）结果对比，以传统血培养法为金标准，分析多重荧光PCR法在血流感染诊断中的特异度和敏感度。 结果 两种方法共检出18种病原微生物。其中，多重荧光PCR法总计检出阳性标本142份，阴性标本114份；与传统血培养法共同阳性标本132份，共同阴性标本111份。多重荧光PCR法与传统血培养法的一致性为91.8%（235/256）；阴性预测值为97.4%（111/114），敏感度97.8%（132/135），特异度91.7%（111/121）。有10例样本多重荧光PCR法阳性而传统血培养结果呈阴性，3例样本传统血培养结果阳性而PCR法呈阴性。有3种病原体超出PCR法检测范围。 结论 本研究多重荧光PCR法能检出患者血培养标本中17种病原体，不仅可以优化传统血培养法流程，大幅缩短报告时间，还可提高血培养法的检出率，特别是对已经抗生素治疗的患者，可减少漏检，提高血流感染的诊断率。

目的 探讨肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、CA19-9、CA72-4、甲胎蛋白（AFP）、CA125在胃间质瘤辅助诊断中的应用价值。 方法 采用横断面研究，收集2014年5月至2017年12月间山东大学齐鲁医院住院的胃间瘤患者41例、胃平滑肌瘤患者11例，取组织进行HE染色、免疫组织化学染色法检测CD34、CD117、DOG-1表达。同期，自山东大学齐鲁医院体检中心选择41名健康志愿者。收集上述患者和健康志愿者血清，使用电化学发光法检测CEA、CA19-9、CA72-4、AFP、CA125水平。采用M-W检验或K-W检验比较各组差异，分析标志物与胃间质瘤临床参数的关系。绘制ROC曲线并计算曲线下面积（area under curve，AUC），计算胃间质瘤诊断临界值（cut-off值）及相应的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。 结果 胃间质瘤患者组织HE染色镜下可见梭形细胞和/或上皮样细胞，CD34、CD117、DOG-1检测呈阳性。胃间质瘤患者血清CEA浓度为1.53（1.15，2.22）ng/ml，高于健康对照组1.06（0.62，1.48）ng/ml及胃平滑肌瘤患者0.79（0.39，1.39）ng/ml（U值分别为446.5、113.0，P均<0.05）。CA19-9在胃间质瘤组9.30（4.95，12.70）U/ml表达高于健康对照组6.62（4.56，8.82）U/ml（U=615.5，P<0.05）。AFP、CA125、CA72-4在3组之间表达差异无统计学意义（H值分别为4.348、1.073、3.897，P均>0.05）。CEA与胃间质瘤分期密切相关（U=129.0，P<0.05）。CA19-9与CEA对胃间质瘤的诊断效能比较，差异无统计学意义（P>0.05），二者联合可提高诊断效能，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、曲线下面积分别为92.7%、48.8%、64.4%、87.0%、0.752。 结论 CEA与CA19-9联合检测对胃间质瘤有较好的敏感度和阴性预测值，有一定的辅助诊断价值。

目的 评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术直接检测肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶效果。 方法 收集2018年1月至5月苏州大学附属第二医院分离的21株对亚胺培南和（或）美罗培南敏感性下降的肠杆菌科菌株，包括11株肺炎克雷伯菌、3株产酸克雷伯菌、3株阴沟肠杆菌、4株大肠埃希菌。PCR检测21株菌株分别产A、B和D类碳青霉烯酶基因情况，同时将菌株与0.5 g/L美罗培南溶液孵育2 h后离心取上清进行MALDI-TOF MS检测，通过菌株水解药物所出现的特征性谱峰来快速判断菌株是否产碳青霉烯酶，并与PCR基因检测结果进行Kappa检验统计学比较。 结果 PCR检测结果提示21株肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因检测均阳性，其中KPC阳性15株、GES阳性6株、NDM阳性2株、VIM阳性1株、GIM阳性4株、SIM阳性1株，同一菌株可产生一种或多种碳青霉烯酶基因。MALDI-TOF MS直接检测结果显示21株菌株与美罗培南孵育后，在质荷比199 m/z左右处均出现了一个特征性谱峰，为菌株产生碳青霉烯酶水解美罗培南药物所致，与PCR检测碳青霉烯酶基因结果高度一致。 结论 本研究运用MALDI-TOF MS技术，可通过捕捉菌株水解碳青霉烯类药物所出现的特征性谱峰来直接检测碳青霉烯酶的产生。

目的 分析临床分离金黄色葡萄球菌生物膜与耐药性间的关系。 方法 参照《临床微生物检验标准化操作》收集广西医科大学第一附属医院检验科于2018年1月自住院患者送检的血液、尿液、痰液及脓性分泌物等临床样本中分离的非重复致病性金黄色葡萄球菌58株，使用刚果红平板法与结晶紫染色法鉴定菌株产膜能力，通过纸片扩散法和VITEK-2全自动微生物药敏试验系统进行药敏分析，采用96孔培养法与结晶紫染色法观察生物膜形成规律及形态。卡方检验用于比较产膜株与非产膜株耐药率的差异，产膜阳性菌株与产膜阴性菌株抑菌圈直径的比较采用t检验，生物膜形成能力不同的菌株间耐药种类的差异采用非参数秩和检验进行分析。 结果 耐甲氧西林菌株产膜率（68.42%）较甲氧西林敏感株高（20.00%）（χ2=12.304，P=0.001），产膜菌株对多种抗菌药物耐药率均高于非产膜菌株，生物膜阳性菌株对苯唑西林与克林霉素耐药率分别为73.33%与53.33%，且生物膜形成能力越强的菌株其耐药种类越多（χ2=9.099，P=0.008）。细菌生物膜的黏附量随着培养时间的推移逐渐增加，72 h后生物膜发展至成熟，成熟的生物膜呈片状复层生长，结构紧密。 结论 对于临床分离的金黄色葡萄球菌，生物膜阳性株耐药率显著高于生物膜阴性株，产膜能力越强的菌株其耐药种类越多，生物膜的粘附量随着培养时间的推移逐渐增加，72 h后生物膜发展至成熟。

目的 探讨具有互换性C反应蛋白（CRP）的正确度验证物质改进CRP不同检测系统检测结果一致性的效果。 方法 横断面研究。将经多系统联合定值的高（H）、低（L）两个浓度水平北京市临床检验中心研制的CRP正确度验证物质采用称重法按5L、4L+1H、3L+2H、1L+4H、5H分别配成5个浓度的校准点，用这5个浓度点分别代替原厂校准品校准德赛、利德曼、西门子和罗氏四个国内外不同试剂品牌的CRP检测系统，然后比校准前后这四个检测系统对21份患者血清以及国际临床化学协会（IFCC）的CRP国际标准物质ERM DA-474的检测测结果的差异，以上每个样本均逐次检测2次。 结果 校准后21份患者系统间样本均值变异系数（CV）中位值从校准前的19.33%下降到2.92%，小于基于生物学变异度导出的最优CV（CV=10.6%）。以德赛为对照系统，其他检测系统作为比较系统，校准前所得的斜率范围为0.90~1.09，校准后为0.93~0.96，斜率更接近1。以ERM-DA474/IFCC作为正确度验证物质时，校准前3个系统2次检测均值的绝对偏倚为3.08~-11.07 mg/L，校准后为-0.52~-2.97 mg/L，绝对偏倚接近其物质本身定值不确定度（2.5 mg/L）。 结论 利用研制的CRP两个浓度正确度验证物质采用称重法配制5个线性点代替厂家校准品去校准CRP的常规检测系统后，各检测系统间的变异系数减小了，正确度提高了。该物质的推广应用，可能会有效提高CRP各检测系统检测结果一致性和准确性。

目的 研究乳腺癌易感基因BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN在中国乳腺癌患者中发生胚系突变的情况。 方法 本研究为探索性研究，选择2016年1月至2018年8月就诊于北京大学人民医院乳腺外科的女性乳腺癌患者128例。其中散发乳腺癌患者44例，具有遗传性乳腺癌高危因素的乳腺癌患者84例。应用二代测序技术对患者进行BRCA1、BRCA2、TP53及PTEN 4个基因的胚系突变情况进行检测。χ2检验分析4种基因突变携带率在散发病例及具有遗传性高危因素的乳腺癌患者之间的分布。按照患者临床特点（有无家族史、是否为三阴型乳腺癌、年龄及是否为双侧乳腺癌）进行分组，其中有明确乳腺癌家族史42例，三阴型乳腺癌34例，早发性乳腺癌33例，双侧乳腺癌7例，Fisher确切概率检验比较BRCA1/2基因致病突变与遗传性高危因素乳腺癌患者临床特征之间的关系。 结果 128例乳腺癌患者中，检测到BRCA1/2胚系突变30例，其中致病突变13例，3例新发突变，BRCA1：c.4760C>G、BRCA2：c.4413_4414del和BRCA2：c.6482_6485del可能为中国人群特有突变。TP53突变3例，其中1例致病突变。3例突变均为早发乳腺癌。5例PTEN突变，其中3例致病突变。在84例具有遗传性高危因素的乳腺癌患者中4种易感基因突变的患者携带率40.5%（34/84），致病突变率15.4（13/84）。44例散发病例中，携带突变率为9%（4/44）。致病突变率为6.8%（3/44）。乳腺癌易感基因在具有遗传性高风险因素的乳腺癌患者携带率更高，与散发病例人群差异存在统计学意义（P<0.001）。BRCA1/2突变在具有遗传性高风险因素的乳腺癌患者各分组中差异均无统计学意义。 结论 乳腺癌易感基因胚系突变检测在乳腺癌风险预测、预后评价等方面具有重要意义。