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The protein X4 of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus is expressed on both virus-infected cells and lung tissue of severe acute respiratory syndrome patients and inhibits growth of Balb/c 3T3 cell lineCHEN Ying-yu, SHUANG Bao, TAN Ya-xia, MENG Min-jie, HAN Pu, MO Xiao-ning, SONG Quan-sheng, QIU Xiao-yan, LUO Xin, GAN Qi-ni, et al.
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.101
背景严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARS-CoV）的基因组包括编码推定蛋白X4（ORF8，ORF7a）的序列，由122个氨基酸组成。推导的序列含有可能的切割信号肽序列和C端跨膜螺旋，表明蛋白X4很可能是I型膜蛋白。本研究旨在证明X4蛋白在SARS-CoV感染过程中是否表达及其重要功能。
方法构建原核和真核X4蛋白表达质粒。重组可溶性蛋白X4从大肠杆菌采用离子交换层析，并将制剂注射到鸡体内以产生特异性多克隆抗体。采用免疫荧光法和免疫组化法检测SARS-CoV感染的Vero E6细胞和SARS患者肺组织中X4蛋白的表达。通过在细胞系中用蛋白X4处理和过表达来评估蛋白X4的初步功能。Western blot用于评估SARS-CoV颗粒中蛋白X4的表达。
结果我们表达并纯化了可溶性重组蛋白X4大肠杆菌，并产生针对蛋白X4的特异性抗体。Western blot证明蛋白X4没有组装在SARS-CoV颗粒中。间接免疫荧光分析显示，在感染后8小时，在SARS-CoV感染的Vero E6细胞中检测到蛋白X4的表达，在SARS患者的肺组织中也检测到蛋白X4的表达。如通过细胞计数和MTT测定所确定的，用蛋白X4处理和过表达抑制Balb/c 3T3细胞的生长。
结论该结果为SARS-CoV感染后X4蛋白的表达提供了证据，可能有助于进一步研究SARS的免疫病理机制。118(4)：267-274
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Cultured human embryonic neocortical cells survive and grow in infarcted cavities of adult rat brains and interconnect with host brainZENG Jin-sheng, YU Jian, CUI Chun-mei, ZHAO Zhan, HONG Hua, SHENG Wen-li, TAO Yu-qian, LI Ling, HUANG Ru-xun
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.102
背景没有关于将培养的人胎儿新皮质细胞外移植到成年大鼠脑的这种梗塞腔中的报道。本研究旨在观察培养的人皮质神经元和星形胶质细胞是否能在成年大鼠脑的梗死腔中存活和生长，以及它们是否与宿主脑互连。
方法在16只成年易卒中肾血管性高血压大鼠中，在纹状体分支远端结扎右侧大脑中动脉。一周后，将来自人胚胎大脑皮质的培养细胞立体定向转移到11只大鼠的梗死腔中。接受假移植的其他5只大鼠作为对照。对于免疫抑制，所有移植大鼠从移植当天开始每天腹膜内注射环孢素A。在灌注的脑切片上进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、突触素、神经丝和微管相关蛋白-2(MAP-2）的免疫组织化学原地移植后8周。
结果10只存活大鼠中有6只的梗死腔中的移植物由外观不成熟的神经元带、纤维束和GFAP免疫阳性星形胶质细胞组成，其分布不均匀。移植物富含突触素、神经丝和具有长突起的MAP2阳性神经元。移植物/宿主边界是弥漫的，树突明显桥接到宿主脑，神经丝免疫阳性纤维伸入其中。
结论培养的人胎脑细胞可在免疫抑制大鼠的梗死腔内存活生长，并与宿主脑融合。118(4)：275-280
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The ectopic study of tissue-engineered bone with hBMP-4 gene modified bone marrow stromal cells in rabbitsJIANG Xin-quan, CHEN Jian-guo, Gittens Sebastien, CHEN Chuan-jun, ZHANG Xiu-li, ZHANG Zhi-yuan
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.103
背景最近报道了结合基因治疗的组织工程技术改善成骨。在本研究中，在兔异位骨形成模型中探索了由人骨形态发生蛋白4（hBMP-4）基因修饰的骨髓基质细胞（bMSCs）构建的组织工程骨。
方法通过亚克隆技术构建pEGFP-hBMP-4哺乳动物质粒(EGFP：增强型绿色荧光蛋白)。将从兔获得的bMSCs培养并用pEGFP-hBMP-4、pEGFP转染或保持未感染体外。通过EGFP的表达检测转移效率。通过RT-PCR检测靶基因的转录。还进行了碱性磷酸酶（ALP）和Von Kossa试验以探索成骨细胞的表型。然后将3组的自体bMSCs与天然非有机骨(NNB)，一种尺寸为6mm × 6mm × 3mm的多孔羟基磷灰石植入物，浓度为5 × 107细胞/ml。随后将它们皮下植入6只兔子体内，单独使用NNB作为空白对照(6每组植入物）。术后四周，用组织学染色和新骨形成的计算机化分析对种植体进行评估。
结果构建pEGFP-hBMP-4表达质粒。在最佳条件下，基因转移效率达到30%以上。目的基因转移可增强BMP-4的转录，增加ALP的表达和钙结节的数量。在异位动物模型中，单独NNB不能诱导新骨形成。bMSCs组新骨形成面积为(17.2±7.1)%,pEGFP组为(14.7±6.1)%, pEGFP-hBMP-4组为(29.5±8.2)%,两组间最高(F=7.295,P<0.01).
结论成功构建了哺乳动物hBMP-4表达质粒，获得了较高的转移效率。基因转移技术增强了BMP-4的表达，促进了bMSCs向成骨细胞的分化。这些体内结果表明，用hBMP-4转染bMSCs可能是增强其固有成骨能力的合适方法，用于骨组织工程应用。118(4)：281-288
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Effects of adenovirus mediated vascular endothelial growth factor gene transfer on reconstitution of hematopoiesis in post-bone marrow transplantation miceZHONG Zhao-dong, ZOU Ping, HU Xian-shi, YOU Yong, CHEN Zhi-chao, HUANG Shi-ang
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.104
背景骨髓移植（BMT）调理程序被认为是骨髓微血管系统受损和造血恢复延迟的原因。然而，尚未研究血管内皮生长因子（VEGF）对BMT后造血的调节。本研究应用腺病毒技术探讨了VEGF基因转移对BMT后小鼠骨髓微环境损伤及促进造血的作用。
方法重组腺病毒(Ad)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)/hVEGF165通过尾静脉注射到接受同基因BMT的BALB/c小鼠中。在BMT后的不同阶段，检测腺病毒分布、血浆hVEGF水平以及外周血白细胞(WBC)、血小板(PLT)和红细胞(RBC)的数量。同时，通过尾静脉注射中国墨水，然后分离胫骨并用于分析骨髓微血管表面积和细胞结构。
结果骨髓移植后不同时期多个器官均有EGFP和hVEGF的表达，血浆hVEGF水平高达(866.67±97.13)pg/ml。重组腺病毒Ad-EGFP/hVEGF治疗组WBC、PLT和RBC的恢复165明显快于其他BMT组（P<0.05)。BMT后第20天，VEGF治疗组骨髓微血管表面积百分比[(61.2±4.0)%]恢复至正常水平[(62.0±5.0)%，P>0.05].造血的恢复比微血管系统的恢复延迟更多。各组骨髓细胞数仍低于正常对照组[(62.3±4.0)%,P<0.05]，但VEGF治疗组在BMT后第20天和第30天的百分比[(46.5±5.0)%和(55.1±4.5)%]高于其他BMT组(P<0.05)。
结论腺病毒介导的VEGF基因转移可能通过保护造血微环境来促进BMT后小鼠造血功能的恢复。118(4)：289-295
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Anti-tumor effect of pEgr-interferon-γ-endostatin gene-radiotherapy in mice bearing Lewis lung carcinoma and its mechanismYANG Wei, LI Xiu-yi
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.105
背景基因-放疗是基因治疗与放疗的结合，是癌症治疗的新范式。为了增强基因放疗的抗肿瘤作用，本研究构建了辐射诱导型双基因共表达载体pEgr-干扰素(IFN)-γ-并研究了pEgr-IFN-γ-endostatin基因—放疗对荷Lewis肺癌小鼠的抗肿瘤作用及其机制。
方法采用基因重组技术构建双基因共表达质粒pEgr-IFN-γ-endostatin和单基因表达质粒pEgr-IFN-γ和pEgr-endostatin。将脂质体包装的质粒局部注射到小鼠肿瘤中，36小时后用5Gy X射线照射肿瘤。观察不同时间的肿瘤生长速度和小鼠的平均生存期。照射后15d测定各组小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤(NK)细胞和腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α分泌活性。照射后10天通过免疫组织化学染色评估肿瘤内微血管密度。
结果基因放疗后不同时间，双基因放疗组小鼠肿瘤生长速度明显低于对照组、5 Gy组和单基因放疗组，平均生存期延长。双基因放疗组小鼠脾CTL、NK和腹腔巨噬细胞TNF-α分泌活性在照射后15d显著高于对照组、5Gy X线照射组和pEgr-endostatin基因放疗组。双基因放疗组小鼠瘤内微血管密度显著低于对照组、5Gy X线照射组和pEGR-IFN-γ基因放疗组。
结论将IFN-γ诱导的抗肿瘤免疫功能增强与内皮抑素的抗血管生成功能相结合，双基因放疗的抗肿瘤效果明显优于单基因放疗。118(4)：296-301
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Mutation analysis of PAX6 gene in a large Chinese family with aniridiaSONG Shu-juan, LIU Ying-zhi, CONG Ri-chang, JIN Ying, HOU Zhi-qiang, MA Zhi-zhong, REN Guo-cheng, LI Ling-song
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.106
背景突变PAX6基因已被证明是无虹膜的遗传原因，无虹膜是一种以虹膜发育不全为特征的严重全眼眼病。然而，没有研究对无虹膜做遗传学分析，尽管国内有几例病例报告。在这里，我们描述了一个突变分析PAX6在一个患有无虹膜的中国大家庭中。
方法制备来自静脉血样品的基因组DNA。用两个遗传标记(D11S904和Dll S935)进行单倍型分析。14个外显子PAX6从基因组DNA扩增基因。通过单链构象多态性（SSCP）分析每个外显子的聚合酶链反应（PCR）产物。对具有异常模式的PCR产物进行测序以确认突变。
结果在受影响的患者中检测到等位基因共享的重要证据表明PAX6突变与该家族中的无虹膜有关。对应于外显子9的额外条带PAX6通过单链构象多态性分析在该家族的所有无虹膜患者中发现，但在未受影响的成员中未检测到。通过在将Arg密码子(CGA)转化为终止密码子(TGA)的核苷酸1080处测序检测到C至T的突变。
结论无虹膜是由无义突变引起的PAX6中国大家庭中的基因。基因检测对于通过产前诊断防止无虹膜传播给家族中的后代是很重要的。118(4)：302-306
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Oncolytic herpes simplex virus vectors for the treatment of human breast cancerLIU Ren-bin, Rabkin Samuel D.
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.107
背景溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)载体可作为直接细胞毒性剂、抗肿瘤免疫应答的诱导剂和抗癌基因的表达剂用于癌症治疗。在该研究中，检测了HSV载体G47 Δ和NV1023治疗人乳腺癌的功效。
方法在BALB/c裸鼠中培养或皮下植入人乳腺癌MDA-MB-435细胞。用G47 Δ或NV1023接种细胞或肿瘤，测定细胞杀伤或肿瘤生长抑制。两种病毒都含有LacZ基因，并用X-gal组织化学检测感染细胞中的表达。
结果G47 Δ和NV1023对MDA-MB-435细胞具有高度细胞毒性体外感染的多重性非常低。感染肿瘤细胞的X-gal染色体外和体内说明了两种病毒的复制和传播。G47 Δ和NV1023接种抑制肿瘤生长并延长小鼠存活。两种载体的行为相似。
结论溶瘤HSV载体G47 Δ和NV1023在杀伤人乳腺癌细胞方面极其有效体外以及在肿瘤异种移植物中体内。这种新形式的癌症治疗值得进一步研究和考虑临床应用。118(4)：307-312
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Enhancing DNA vaccine potency against hantavirus by co-administration of interleukin-12 expression vector as a genetic adjuvantZHENG Lan-yan, MOU Ling, LIN Song, LU Run-ming, LUO En-jie
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.108
背景肾综合征出血热的高发病率和高死亡率，以及没有特效药物治疗该病，清楚地表明需要开发更有效的汉坦病毒疫苗。现在正在深入研究改进DNA疫苗接种策略以引发更多临床有效的免疫应答。在本研究中，我们检测了使用白细胞介素-12表达质粒作为遗传佐剂增强基于编码核衣壳蛋白的S基因的DNA疫苗诱导的针对汉坦病毒的免疫应答的效果。
方法通过肌内接种编码汉坦病毒核衣壳蛋白的DNA疫苗单独或与表达鼠白细胞介素-12(pcIL-12)的质粒组合免疫BALB/c小鼠三次。加强免疫接种以2周间隔进行2次。为了评估体液和细胞免疫应答，分别采用MTT法和ELISA法测定抗原特异性淋巴细胞增殖和抗体产生。于初次免疫后第5、10、17、35和42天用ELISA试剂盒检测脾淋巴细胞培养上清中白细胞介素-4和干扰素-γ的水平。
结果实验组中抗原特异性IgG抗体在第17天显著增加，并在第35天后达到平台期。当共注射pcIL-12时，抗原特异性IgG水平在这段时间内显示出显著的抑制，并且抗体平均滴度在初次免疫后第42天降至仅约1:50，显著低于仅用pcDNA3.1+S免疫的组，其中平均滴度为约1：70。与单独注射pcDNA3.1+S相比，通过共注射pcIL-12显著增加干扰素-γ。然而，白细胞介素-4的产生被pcIL-12共注射抑制。此外，pcIL-12共注射有效增强抗原特异性淋巴细胞增殖。
结论pcDNA3.1+S接种引起的体液和细胞因子应答可以通过与pcIL-12共接种来调节，并有效诱导Th1显性免疫应答。118(4)：313-319
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Relationship between tunnel widening and different rehabilitation procedures after anterior cruciate ligament reconstruction with quadrupled hamstring tendonsYU Jia-kuo, Paessler H. Hans
Chinese Medical JournalVol.118,No.042005
DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.2005.04.109
背景已经证明，膝关节前交叉韧带（ACL）重建后可能出现骨隧道增宽，尤其是那些用半腱肌和股薄肌腱重建ACL断裂的患者。许多因素会影响隧道拓宽的程度。很少有研究调查骨隧道加宽与康复程序之间的关系。本研究旨在探讨康复程序对前交叉韧带重建后胫骨隧道加宽的影响。
方法将65例采用四重半腱肌和股薄肌腱进行ACL重建的病例分为两组。A组33例，男19例，女14例，平均年龄(31.2±12.4)岁，仅采用Paessler技术进行前交叉韧带重建，术后采用积极的康复措施恢复功能。B组32例，男20例，女12例，平均(30.3±10.3)岁。B组除ACL重建外，均采用再固定方法进行半月板修复或微骨折技术进行软骨修复，术后采用保守康复治疗。术后6个月，每例患者取标准后前位片，用CorelDRAW 8.0软件对所有X线片进行数字化处理，测量胫骨隧道的上、中、下三个部位。测量后取出X射线板的放大效应。
结果ACL重建后6个月，采用积极康复程序的A组在后—前和侧位X线钢板上的胫骨隧道上、中、下部分增宽比采用保守康复程序的B组严重得多。KT-1000膝关节稳定性测量和临床表现显示两组之间无差异。
结论ACL重建后的康复程序是隧道加宽的原因之一。它不仅可以直接影响ACL重建膝关节的功能恢复，还可能通过影响隧道加宽间接影响手术膝关节的功能恢复和远期临床结果。118(4)：320-326
