2022年 · 第45卷第03期

伴随着精准医学理念的发展，在新型冠状病毒肺炎疫情流行的背景下，感染性疾病的临床诊疗愈发得到重视，而以分子生物学为核心的实验诊断技术作为感染性疾病临床实验诊断的重要手段尤其受关注。近年来，随着纳米材料、应用化学、光物理学和生物传感等技术的进步，分子诊断技术也迎来了革命性和创造性的发展。新一代定量PCR技术和基因测序技术、等温扩增技术、生物芯片和生物传感器技术在感染性疾病的临床诊断中具有应用前景和发展前途。

数字PCR（dPCR）是近年迅速发展起来的一种绝对定量的技术，该技术将含有DNA模板的反应体系分配到大量独立的反应单元中进行PCR，根据泊松分布和统计阳性信号来计算DNA拷贝数。与传统的qPCR相比，dPCR不依赖于扩增曲线，不受扩增效率的影响，具有较高的准确度和重复性，可以实现绝对定量。本文综述了数字PCR发展历史以及在感染性疾病分子诊断、肿瘤液体活检、产前诊断等方面的应用进展，并展望了该技术的应用前景。

类泛素化Neddylation修饰是一种新型蛋白质翻译后修饰方式，其在消化系统肿瘤中过度活化，是潜在的抗肿瘤分子靶标。靶向Neddylation修饰通路通过诱导消化系统肿瘤细胞发生细胞周期阻滞、细胞凋亡、细胞衰老和自噬，以及增强消化系统肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性，继而发挥抗肿瘤作用。靶向Neddylation修饰通路及通路抑制剂MLN4924可作用于抗消化系统肿瘤的潜在靶点。

目的 采用血清代谢指纹采集方法筛选肺癌相关差异调控代谢物，为肺癌诊断提供候选标志物。 方法 在上海长海医院开展队列入组工作，共纳入2021年1月27日至6月4日的228例受试者，其中包括初诊确认肺癌患者97例和健康体检人群131名。根据标准流程采集入组队列血清样本，并通过分层随机抽样，将入组队列分为训练集和完全独立的验证集。采用纳米辅助激光解吸电离质谱对血清样品进行代谢指纹图谱采集。对训练集样本年龄、性别进行质量控制后，通过机器学习算法构建基于血清代谢指纹图谱的诊断模型，并采用受试者工作特征（ROC）曲线评价模型的分类效能。 结果 通过新型纳米辅助激光解吸电离质谱，可在1 min内完成血清样品的代谢指纹提取，过程仅需消耗1 μl原始血清。针对训练集，基于此构建的分类器诊断肺癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.92（95%CI 0.87~0.97），敏感度为89%，特异度为89%。在独立验证队列中，AUC为0.96（95%CI 0.90~1.00），敏感度为91%，特异度为94%，没有表现出性能损失。确定了由5个代谢物组成的标志物组合，展示了肺癌患者的独特代谢模式。 结论 本研究结合血清代谢指纹图谱和机器学习建立了肺癌的诊断模型，用于区分肺癌患者以及健康对照，可用于临床的体外诊断。

目的 分析老年非小细胞肺癌（NSCLC）患者中血管内皮生长因子受体（EGFR）突变、程序性死亡配体1（PD-L1）、细胞增殖相关抗原（Ki-67）表达及其与患者性别、组织学类型、TNM分期等临床参数间的相关性。 方法 收集2020年1月至12月在复旦大学附属华东医院就诊的340例老年NSCLC患者组织标本，其中男性195例，女性145例，年龄（68.9±6.0）岁。按性别、组织学类型及TNM分期等临床参数对患者进行分组。采用超级突变扩增阻滞系统（Super-ARMS）方法及免疫组化方法检测老年NSCLC患者中EGFR突变、PD-L1及Ki-67的表达情况，对EGFR突变、PD-L1及Ki-67的表达与临床参数间的相关性进行统计学分析，采用Pearson相关分析EGFR突变与PD-L1及Ki-67表达间的相关性。 结果 在老年NSCLC患者组织标本中，EGFR突变阳性率为48.53%（165/340），以L858R和19del突变最为常见，分别为56.36%（93/165），30.30%（50/165）。其中EGFR的突变率在女性、肺腺癌、高分化、Ⅰ+Ⅱ分期患者中较高，分别为65.52%（95/145）、53.77%（164/305）、56.75%（143/252）、52.53%（135/257）。此外，PD-L1表达阳性率在老年肺非腺癌患者和中/低分化腺癌中较高，分别为37.14%（13/35），24.53%（13/53）。PD-L1表达阴性率在Ⅰ+Ⅱ期、淋巴结未转移及Ki-67弱阳性老年NSCLC患者中较高，分别为89.11%（229/257）、87.63%（248/283）、94.71%（197/208）。相关性分析显示，EGFR突变与PD-L1及Ki-67的表达呈负相关（PD-L1：r=-0.22，P<0.001；Ki-67：r=-0.32，P<0.001）。 结论 老年NSCLC患者中EGFR突变与PD-L1及Ki-67表达呈负相关，EGFR突变与PD-L1表达联合检测对指导老年NSCLC患者的靶向用药和免疫治疗具有重要的意义。

目的 构建基于长链非编码RNA（lncRNA）的膀胱癌（BLCA）预后模型。 方法 从TCGA下载BLCA的lncRNA表达数据及临床信息，利用单因素Cox回归评估每个lncRNA表达水平与患者总生存期（OS）的相关性，将经多重比较校正P值<0.01的lncRNA作为候选预测变量，再在训练队列中通过最小化绝对收缩和选择算子回归、多因素逐步Cox回归等方法构建预测模型。同时在验证队列中验证该模型。统计时间依赖的受试者工作特征（tROC）曲线下面积以及Harrel C指数。并将患者预测模型风险评分中位数将患者分为高风险组和低风险组，通过t检验或卡方检验比较两组间临床病理特征差异。 结果 建立基于13个lncRNA的BLCA预后模型，其中LINC01465、ARHGAP5-AS1、ZFHX4-AS1、MAFG-AS1为预后危险因素（β值分别为0.32、0.16、0.06、0.20），其余为保护因素（β值均<0）；该预测模型在完整队列中第1年、第3年、第5年OS的tROC曲线下面积为0.79、0.82、0.80，Harrell C指数为0.74。校正包括年龄和肿瘤分期在内的混杂因素发现，该模型风险评分为BLCA患者总生存的独立不良预后因素（风险比为4.05，P<0.001）。高风险和低风险组患者临床病理特征比较显示，高风险组年龄较低风险组年龄大（70.0 岁>66.1岁，P<0.001）、非乳突型患者较多［74.2%（147/202）比61.2%（123/202），P=0.005］、高分期患者较多［Ⅳ期患者为37.6%（76/202）比28.0%（56/202），P<0.001］、高级别肿瘤较多［98.0%（198/202）比92.0%（183/202），P=0.005］。 结论 成功建立了基于13个lncRNA的膀胱癌预后模型，该模型可为临床决策和患者咨询提供参考价值。

目的 评估血浆外泌体源环状RNA（circRNA）hsa_circ_0064910在胃癌中的诊断效能，分析其与胃癌患者临床病理特征的相关性。 方法 回顾性研究，纳入2019年10月至2020年12月在河南大学第一附属医院入院治疗的60例胃癌患者，30例慢性胃炎患者（疾病对照组）以及同期健康体检的30名健康者（健康对照组）作为研究对象。收集胃癌患者的一般资料，包括肿瘤大小、分化程度、TNM 分期、有无淋巴结转移等。临床治疗前收集患者血液标本，逆转录聚合酶链反应分别检测3组对象血浆外泌体中hsa_circ_0064910的表达水平，电化学发光法检测同一研究对象血清CEA、CA19-9的表达水平。利用受试者工作特征（ROC）曲线评价hsa_circ_0064910单独诊断及其与CEA、CA19-9联合检测在胃癌患者中的诊断效能。同时分析血浆外泌体hsa_circ_0064910在胃癌患者术前术后的表达差异，以及与胃癌患者临床病理特征的关系。 结果 胃癌患者血浆外泌体中hsa_circ_0064910的相对表达水平（0.97±0.12）高于慢性胃炎患者（0.47±0.06）（t =2.97，P<0.001）及健康对照组（0.43±0.05）（t =3.23，P<0.001）。ROC曲线分析显示hsa_circ_0064910单指标诊断胃癌的曲线下面积（AUC）为0.778，联合CEA、CA19-9指标诊断胃癌的曲线下面积（AUC）为0.841，高于CEA（AUC=0.673）、CA19-9（AUC=0.653）单指标及联合检测的诊断效能。临床资料分析表明血浆外泌体hsa_circ_0064910的相对表达量与肿瘤大小（χ²=7.545，P<0.01）、临床分期（χ²=4.571，P<0.05）及淋巴结转移（χ²=6.907，P<0.01）等密切相关。胃癌患者术后血浆外泌体hsa_circ_0064910的相对表达量明显下降（1.21±0.21比0.62±0.11，t =2.463，P<0.01）。 结论 外泌体源hsa_circ_0064910在术前胃癌患者血浆中相对表达量较高，有望成为胃癌筛查新型无创分子标志物。

目的 探究同时伴有低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（LDLRAP1）及胆固醇转运蛋白三磷酸腺苷结合盒转运体G8（ABCG8）基因异常的家族性高胆固醇血症（FH）一家系的临床及分子生物学特征。 方法 2020年9月于上海交通大学医学院附属瑞金医院收治1例FH患者，采集该家系成员外周静脉血样本，检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）；用高效液相色谱法检测血清豆固醇和谷固醇含量。二代基因测序检测先证者及家系成员基因变异情况。采用Pymol软件对基因变异位点进行致病性分析，并使用Uniprot Modelling软件行蛋白结构建模。 结果 先证者表现为贫血合并多部位黄色瘤、早发急性冠状动脉综合征。冠状动脉造影示冠状动脉三支严重病变；腹部超声示脾肿大；血涂片示异型红细胞、大血小板散在可见；血清TC、LDL-C、豆固醇和谷固醇浓度均升高［分别为8.54 mmol/L（正常值2.3~5.7 mmol/L）、4.84 mmol/L（正常值1.3~4.3 mmol/L）、44 μmol/L（正常值1.0~10 μmol/L）、28 μmol/L（正常值1.0~15 μmol/L）］。基因测序示：LDLRAP1：NM_015627.2：exon 4 c.415 C>T（p.Q139X），该纯合突变形成的蛋白截断体丢失多个稳定蛋白结构区域，不具备正常功能。同时，先证者发现ABCG8基因变异：exon13 c.1895T>C（p.V632A），exon8 c.1199C>A（p.T400K）。2例家系成员HDL-C增高（Ⅱ5：2.33 mmol/L，Ⅱ6：2.96 mmol/L）；3例带ABCG8基因变异的成员豆固醇（Ⅱ8：23 μmol/L，Ⅱ7：24 μmol/L，Ⅰ2：18 μmol/L）、谷固醇（Ⅱ8：41 μmol/L，Ⅱ7：33 μmol/L，Ⅰ2：45 μmol/L）轻度增高。 结论 同时伴有LDLRAP1及ABCG8基因异常的FH患者，可出现植物固醇浓度异常，其临床表现更加复杂，应综合考虑家族史及LDL-C、植物固醇水平及基因检测结果。

目的 探究直接法测得的血低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）餐后水平低于空腹水平的原因。 方法 选择中南大学湘雅二医院2017年11月至2019年5月的85名受试者进行前瞻性研究。取受试者空腹和进食后2、4 h的血清样本，分别用直接法和磁共振波谱技术（NMRS）检测样本的血脂水平，并用酶联免疫吸附法检测前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）的水平。用Friedman双向秩方差分析和韦氏配对符号秩次检验比较不同时间点血脂组分的差异；采用Spearman相关分析分析PCSK9水平与脂蛋白颗粒数之间的相关性。 结果 经直接法检测，与空腹状态比较，进食后2、4 h的LDL-C均有下降［分别为2.58（2.09，3.12）、2.47（1.92，3.02）、2.37（1.82，2.80）mmol/L，P<0.001］。经NMRS检测，空腹和餐后2、4 h低密度脂蛋白（LDL）颗粒浓度分别为1 086（830，1 239）、1 083（848，1 213）、1 061（814，1 213）nmol/L（P=0.417）；LDL颗粒中胆固醇浓度分别为2.13（1.56，2.54）、2.16（1.68，2.50）、2.06（1.58，2.50）mmol/L（P=0.047），但餐后2、4 h与空腹比较，差异均无统计学意义（P均>0.05）。而大颗粒的LDL浓度［空腹、餐后2、4 h分别为185.2（150.6，221.6）、173.0（144.8，220.3）、178.1（144.0，233.6）nmol/L，P=0.001］，以及餐后2、4 h大颗粒的LDL中的胆固醇浓度均较空腹时下降［空腹、餐后2、4 h分别为0.49（0.39，0.57）、0.47（0.38，0.57）、0.46（0.37，0.58）mmol/L，P<0.001］。同时，进食后PCSK9水平也明显下降［分别为299（233，397）、257（208，342）、251（215，340）ng/ml，P<0.001］，餐后4 h血清PCSK9的下降比例与NMRS所检测的餐后残粒胆固醇增长比例呈正相关（r=0.232，P=0.035）。 结论 磁共振波谱技术与直接法测得餐后LDL-C水平不一致。直接法测得的餐后LDL-C的下降并非LDL颗粒的清除，而是由于胆固醇在各LDL亚组分中的重新分布。

目的 评估自动化磁珠法提取儿茶酚胺代谢物联合液相色谱串联质谱进行检测的性能。 方法 方法学评价类研究。参考CLSI C62-A、《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》等指南，本研究评估使用磁珠法提取血浆中儿茶酚胺代谢物3-甲氧基肾上腺素（MN）、3-甲氧基去甲肾上腺素（NMN）和3-甲氧基酪胺（3-MT）联合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定的线性、定量限、回收率、精密度以及基质效应等，并收集132份临床剩余血浆样本，同时使用磁珠法和传统固相萃取法2种前处理方法进行提取，经LC-MS/MS测定后比较2种提取方法结果的一致性。 结果 自动化磁珠法提取MN、NMN和3-MT的线性均>0.99；定量限分别为0.033 5、0.054 7和0.011 0 nmol/L；MN、NMN和3-MT重复性分别为：1.3%~5.1%、2.2%~5.6%和1.7%~7.1%；实验室内总不精密度分别为：1.5%~8.2%、2.2%~7.7%和2.1%~11.2%；虽然绝对回收率较低，但是MN、NMN和3-MT平均相对回收率分别为91.5%~108.5%、92.0%~108.6%和89.3%~104.1%，与预期浓度百分偏差均在15%以内。经过同位素内标校正后，相对基质效应均在100%左右，可抵消潜在的基质效应。固相萃取和磁珠2种方法提取MN、NMN和3-MT结果相关性均良好（相关系数r>0.99），2种方法比较MN、NMN和3-MT平均相对百分偏差分别为0.2%、-1.4%和1.0%。 结论 本研究中自动化磁珠法前处理提取儿茶酚胺代谢物性能良好，有望提高临床检测自动化及通量。

目的 应用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术，筛选对结核病诊断有辅助意义的代谢性生物标志物。 方法 回顾性病例对照的临床研究。随机选取2017年1月至2018年1月就诊于上海市肺科医院和上海市东方医院的102例结核病患者［男49例，女53例，年龄为40.0（24.0，48.5）岁］、100例就诊于上海市东方医院经结核分枝杆菌γ干扰素释放试验（TB-IGRA）检测为阳性者［男55例，女45例，年龄为44.0（37.0，52.0）岁］和96名健康体检者［男55例，女41例，年龄为43.0（32.2，52.8）岁］。采用UPLC-Q-TOF/MS技术分别检测其血浆中的小分子代谢物，结合多元统计方法变量投影重要性（Variable Importance Projection，VIP）及单变量统计分析t检验方法筛选活动性结核病患者血浆中主要的差异代谢物，并对代谢差异物进行单变量受试者工作特性（ROC）曲线分析，计算曲线下面积值及用于结核病诊断的特异度和敏感度。 结果 所有样本检测得到10 266个变量，经人类代谢组数据库检索定性，初步鉴定出1 153种物质。3组样本两两比较后，将同时满足VIP>1和P<0.05的差异代谢物绘制韦恩图，得到的交集中含有38种主要差异代谢物。ROC曲线评估38个主要差异代谢物对活动性结核病的诊断效能，发现乳酸、多巴胺、9-十五碳烯酸及12，13-二羟基亚油酸在诊断活动性结核病时，其曲线下面积分别是0.92、0.98、0.94和0.94，特异度均大于90%，敏感度均大于80%，4种代谢标志物联合诊断活动性结核病的特异度和敏感度均为94%。 结论 筛选出的4种代谢标志物乳酸、多巴胺、9-十五碳烯酸及12，13-二羟基亚油酸对结核病的诊断具有良好的诊断效能。

目的 用机器学习算法建立IgA肾病与非IgA肾病鉴别诊断模型。 方法 采用回顾性研究的方法，收集2019至2020年昆明医科大学第一附属医院、云南省第一人民医院和昆明市延安医院肾脏内科经肾脏病理确诊的患者共260例，其中原发性IgA肾病130例，非IgA肾病130例。收集包括性别和年龄等在内的28项临床资料和实验室常规检测结果，IgA肾病组与非IgA肾病组的男女构成比分别为59∶71和 64∶66，年龄分别为37.20（21.89，53.78）、43.30（27.77，59.18）岁。将260例患者随机地分为训练集（70%，182例）和测试集（30%，78例）。分别使用决策树、随机森林、支持向量机、极限梯度提升算法建立原发性IgA肾病与非IgA肾病的鉴别诊断模型。以真阳性率、真阴性率、假阳性率、假阴性率、准确率、受试者特征工作曲线下面积（AUC）、精确率、召回率和F1评分综合评估各模型的效能并选择性能最佳的模型。采用 SPSS 25.0对数据进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。 结果 采用决策树、支持向量机、随机森林和极限梯度提升算法建立鉴别诊断模型的准确度分别为67.95%、70.51%、80.77%和83.33%；AUC值分别0.74、0.76、0.80和0.83；判断为原发性IgA肾病的F1评分分别为0.73、0.72、0.80和0.83。综合以上评价指标极限梯度提升算法模型的效能最高，该模型诊断为IgA肾病的敏感度、特异度分别为89%、79%，其变量重要性由高到低分别为血白蛋白、IgA/C3、血肌酐、年龄、尿总蛋白、尿白蛋比、高密度脂蛋白、尿素。 结论 成功建立IgA肾病与非IgA肾病的鉴别诊断模型。采用极限梯度提升算法建立的模型临床性能最佳。

目的 观察液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与免疫法检测多种类固醇激素的一致性。寻找多种类固醇激素在21-羟化酶缺乏症（21-OHD）中的诊断价值、筛选随访指标。 方法 2019年5月至2020年5月，武汉儿童医院收集实验组为109例接受规范治疗的经典型21-OHD患者，对照组为94名正常儿童。同时用免疫法和LC-MS/MS法检测17-羟孕酮（17-OHP）、雄烯二酮（Δ4-A）、睾酮和皮质醇。采用LC-MS/MS法检测另外16种肾上腺类固醇激素。实验组分为过度治疗组（17-OHP<4 ng/ml）、控制良好组（4 ng/ml≤17-OHP<12 ng/ml）和控制欠佳组（17-OHP≥12 ng/ml）。分析免疫法与LC-MS/MS检测结果的一致性，比较21-OHD患者与对照组LC-MS/MS血清多种类固醇浓度差异，发掘多种类固醇激素检测的诊断价值，比较不同疗效21-OHD患者20种类固醇浓度差异，筛选更有价值的随访指标。 结果 （1）LC-MS/MS与免疫法同时检测的4项指标中，T、17-OHP的一致性高。免疫法测定的皮质醇和Δ4-A浓度高于LC-MS/MS。（2）LC-MS/MS检测的肾上腺分泌的20种类固醇激素中21-OHD患者较对照组有6种激素明显偏高，6种激素明显偏低，8种没有统计学差异。（3）抑制过度组17-OHP降低、11-脱氧皮质醇升高；控制欠佳组17-OHP、孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、21-脱氧皮质醇、Δ4-A、雌酮升高。 结论 LC-MS/MS可一次性检测多种类固醇激素，评价维度更多面。随访中20种激素中仅8种与患者控制状态密切相关，可减少不必要的消耗。

鉴于目前一代测序通量低，二代测序读长短的限制，一种新的克服上述缺点的技术应运而生。基于纳米孔的三代测序技术不依赖DNA聚合酶的链式反应，通过识别电信号判别碱基，具有广泛的应用前景，同时也面临着更多挑战。目前在在感染性病原、传染病防控、遗传变异及肿瘤诊断等方面有诸多应用。

遗传性代谢病是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和（或）蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽（蛋白）的基因发生变异而导致的疾病。通过对机体血液或尿液中糖、氨基酸、有机酸、脂肪酸、肉碱等物质代谢组学分析，以及细胞酶学、分子生物学与蛋白组学分析，鉴定、识别以及定量各异常指标，确定生物标志物作为诊断和治疗监测工具，同时通过蛋白组学的研究，为遗传性代谢病的致病机制提供科学依据。

核磁共振波谱是代谢组学的主要分析技术之一，该技术具有操作简单、快速和非侵入性等优点，通过监测机体代谢物的变化，有助于深入了解疾病机制，能够在疾病诊疗中发挥作用，但其临床应用尚未普及。近年来，代谢组学在肿瘤中的应用日益成为研究热点，因此本文围绕核磁共振波谱技术和肿瘤代谢组学，着重介绍基于该技术的代谢组学分析在肿瘤早期筛查、临床诊断和预后评估等方面的应用进展，以期为肿瘤代谢组学的研究和临床应用提供参考。

人工神经网络（ANN）是一种驱动人工智能（AI）的网络框架，其中采用经典卷积神经网络（CNN）进行胚胎质量评估可进行固定时间节点胚胎细胞计数和图像识别；采用全连接的深度神经网络（DNN），胚胎图像识别准确度提升，适用于较高硬件配置以及需要整合临床信息进行综合预测；残差网络通过增加层数提高准确度并通过跳跃连接解决梯度消失问题，实现动态胚胎评估。贝叶斯网络（BN）机器学习擅长推理，在条件缺失情况下可通过推理弥补数据不足，可结合临床复杂信息进行综合预测评估；支持向量机（MLP）机器学习存在梯度消失与爆炸，容易丢失图像部分空间特征，适用于小样本评估。ANN在预测胚胎植入率、胚胎非整倍体方面具有一定优势，开发新的胚胎质量评估方法减少侵入性检测是人类辅助生殖技术（ART）重要研究方向。