2025年 · 第48卷第10期

基于Cas蛋白的“反式切割”效应，CRISPR/Cas系统已成功从基因编辑工具转型为新一代分子诊断平台。该技术在生物标志物即时检测中展现出快速、操作简单等特点，却仍面临着灵敏度不足、多重检测能力有限等关键挑战。最近研究表明，通过蛋白工程、微流控集成和人工智能算法优化等策略，CRISPR/Cas诊断技术正推动分子诊断向现场化、智能化发展，为标志物现场筛查提供新的解决方案。

2023—2025年，猴痘疫情已先后引发两轮国际关注的突发公共卫生事件，对全球卫生健康体系造成极大冲击。快速、灵敏、准确的检测方法对于猴痘病毒早发现和早治疗至关重要。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统以其特有的靶标核酸识别切割能力和反式切割活性为特点，已作为新一代核酸检测工具广泛用于病原体诊断领域。CRISPR/Cas与不同扩增和信号读取技术相结合也已被广泛用于猴痘病毒检测中。虽其仍面临较多挑战，但随着研究不断深入，基于CRISPR/Cas系统有望实现多元化发展，为相关传染性疾病快速、准确且廉价的检测方法开发提供强大技术支持。

CRISPR/Cas系统近年来在多重检测领域展现出巨大潜力。相比传统核酸检测方法如qPCR与NGS，CRISPR多重检测具备操作简便、灵敏度高、成本低等优势，尤其适用于病原体筛查与癌症早检等场景。针对CRISPR多重检测的核心难题，发展出“一锅式”“空间隔离”和“逻辑门”三类多重检测策略。各类策略有效实现多个靶标的同步识别与信号放大，并成功应用于病毒检测、耐药筛查与肿瘤分子标志物识别。尽管CRISPR多重检测仍面临交叉干扰和系统构建复杂等挑战，但该技术正持续加速发展，展现出广阔的临床应用与转化前景。

病原体检测是感染性疾病早期诊断与防控的关键。成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）序列及 CRISPR相关蛋白（Cas）系统（CRISPR/Cas）因其高特异性、可编程性和反式切割活性，已成为病原体检测领域的重要工具。基于CRISPR/Cas系统的生物传感器不断发展，通过与多种新型检测策略相结合，显著降低了检测成本与时间，大幅提升了操作的简便性和平台的实用性，在病原体诊断领域展现出广阔的临床应用前景。

自动审核是指在遵循临床实验室操作规程的前提下，计算机系统按照预先设置的并已通过验证的规则、标准和逻辑，自动对检测结果进行审核并发布检验报告成为医疗记录的行为。自动审核系统的建立对于提高工作效率、缩短检测周转时间、减少差错率、均衡员工技术差异、保证结果准确性等方面具有重要意义。为促进我国临床实验室检验结果自动审核程序的开发与应用，并适应实验室信息化、自动化与智能化发展的需要，特制定专家共识，旨在指导临床实验室科学、规范、合理地建立及应用自动审核程序。该共识从自动审核程序设计、构建、验证、实施、管理的流程方法及应用等方面提供了指导建议，希望进一步提高临床实验室工作效率和质量水平，推动临床实验室向更高层次的自动化与智能化迈进。

凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物的定量检测在血友病A及获得性血友病A的鉴别诊断、治疗方案选择及治疗效果监测等环节中均起着至关重要的作用。而检测过程中的影响因素较多，检验人员的相关概念较为模糊，加之新型非因子治疗药物的使用，使得FⅧ抑制物定量检测的标准化面临着巨大的挑战。本共识结合国内外相关文献及国内专家丰富的临床实践经验，以期推进我国FⅧ抑制物定量检测的标准化。

目的 建立一种基于突变型GPⅠbα检测血管性血友病因子（vWF）活性的流式微球技术（FCBA）检测vWF活性的方法，进行临床验证。 方法 通过构建M239V、D235Y和C65A点突变的GPⅠbα重组蛋白结合于流式微球，样本的vWF与其结合，加入异硫氰酸荧光素标记（FITC）的兔抗人vWF多抗，通过流式细胞仪检测分析。分别收集选择2022年1月1日至2023年11月30日期间在苏州大学附属第一医院血液科就诊的血管性血友病患者男性10例，女性22例。年龄（26.81±6.96）岁，以及健康对照组51名，其中男性17名，女性34名，年龄（31.56±8.98）岁。取20份健康对照组血浆等比例混合成标准血浆，从血浆原液到1∶8 192，倍比稀释14个稀释度，按照FCBA法操作步骤，并绘制曲线，确定最佳稀释度。取一份健康对照组血浆分装冷冻，于包球后的第1、5、15、30、45、60天用FCBA法检测，评价其稳定性。对同一份健康对照组的血浆用FCBA法和vWF酶联免疫吸附（ELISA）法重复检测20次，计算批内精密度。同一样本连续10 d每分别用FCBA法和vWF-ELISA法检测，计算批间精密度。用FCBA法检测所有样本，同时用vWF-ELISA法对相同样本进行检测，采用χ2检验对两种方法阳性率、阴性率和准确度进行比较。取一份样本作为基础样品，另取一份已知活性为100%的样品，稀释为高中低活性后加入基础品中，分别用FCBA法和vWF-ELISA法检测并计算回收率。重新收集vWD患者样本11例，健康体检者10例，用FCBA法检测vWF的活性，验证FCBA在临床的应用中的符合度。 结果 标准血浆原液倍比稀释到1∶64为最佳稀释度。微球包被60 d后依然可以稳定检测，第1、5、15、30、45、60天的标准曲线相关系数分别为0.98、0.98、0.97、0.95、0.95、0.95。FCBA法和vWF-ELISA法两种方法的批内变异系数分别为5.35%和6.08%，批间变异系数分别为7.02%和7.98%。FCBA和vWF-ELISA法的相关系数为R2=0.798（P0.01），阳性率分别为90.63%和84.38%（χ2=0.571，P0.05），阴性率分别为92.16%和94.12%（χ2=0.153，P0.05），准确度分别为91.57%和90.36%（χ2=0.073，P0.05）。FCBA和ELISA两种方法在回收实验中高值回收率分别为102.11%和99.32%，中值回收率为98.50%和95.66%，低值回收率为95.34%和88.51%。FCBA法检测1型、2型和3型vWD以及健康体检者的符合率都达到了100%。 结论 成功建立一种基于突变型GPⅠbα的、不依赖于瑞斯托霉素的FCBA检测vWF活性的方法。

目的 建立基于重组酶聚合酶扩增（RPA）与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）技术的一锅法干粉化检测体系，用于肝移植受者巨细胞病毒（CMV）感染的快速诊断。 方法 方法学建立研究。根据CMV基因序列设计CRISPR RNA（crRNA）和RPA引物，筛选最优RPA引物，建立基于RPA-CRISPR/Cas13a的CMV检测体系。使用梯度稀释的CMV质粒标准品评估最低检测限；常见器官移植机会感染病毒的基因组DNA评估交叉反应性；CMV阴性和阳性样本评价干粉试剂检测效果。使用两独立样本的t检验和单因素方差分析计算P值，比较荧光值差异。临床验证采用干粉试剂检测2024年6月3日至2025年5月31日收集于上海交通大学医学院附属仁济医院的22例肝移植受者血浆样本，并与实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测结果进行比较。使用Kappa检验计算检测结果Kappa系数，评价两种方法的一致性。 结果 建立的RPA-CRISPR/Cas13a反应体系最低检测限可达1拷贝/反应，且与其他常见器官移植机会感染病毒不产生交叉反应。使用干粉试剂检测22份临床样本的结果与qPCR检测结果的符合率为100%（22/22）。 结论 本研究成功建立了基于RPA-CRISPR/Cas13a技术的干粉化CMV检测方法，可用于肝移植受者CMV感染的便捷检测。

目的 探究EB病毒（EBV）感染对初诊多发性骨髓瘤（MM）患者疗效及预后的影响。 方法 回顾性分析2019年6月1日至2021年2月25日复旦大学附属中山医院收治的196例初诊MM患者的临床资料。根据初诊外周血单个核细胞EBV DNA检测结果分成EBV阳性组（106例）和阴性组（90例）。分析各型别和修订的国际分期系统（R-ISS）各分期中的EBV阳性率分布，并比较EBV阳性患者R-ISS各分期EBV DNA载量水平。采用秩和检验、2×2列联表卡方检验和独立样本t检验比较2组间肝肾功能、免疫组表型和细胞遗传学等实验室检查结果、治疗疗效及生存预后等情况，通过生存分析及Cox回归探究EBV阳性MM患者的临床预后。 结果 初诊MM患者EBV阳性率为54%（106/196），κ轻链型患者的阳性率最高（9/12）。R-ISS Ⅲ期患者的阳性率高于Ⅰ期（χ2=4.68，P=0.031）和Ⅱ期（χ2=6.04，P=0.014），但各分期EBV阳性MM患者的EBV DNA载量间差异无统计学意义（Z=3.27，P=0.195）。EBV阳性组血清肌酐（Scr）和β2-微球蛋白（β2-MG）水平高于EBV阴性组（Z=1.98，P=0.048和Z=2.08，P=0.038），且发生t（4；14）的比例也高于EBV阴性组（χ2=3.93，P=0.047）。EBV阳性组在完成第4周期化疗后达到完全缓解（CR）/严格意义的完全缓解（sCR）和非常好的部分缓解（VGPR）的比例低于EBV阴性组（χ2=12.82，P=0.001和χ2=8.30，P=0.004），而发生疾病进展（PD）的比例高于EBV阴性组（χ2=4.48，P=0.046）。EBV阳性组MM患者的2年无进展生存期（PFS）较EBV阴性组短（Z=-4.50，P0.01）。Cox回归分析显示，R-ISS Ⅲ期（HR=5.38，95%CI 1.28~22.56，P=0.021）、化疗4周期后未达VGPR（HR=3.02，95%CI 1.42~6.46，P=0.004）、EBV阳性（HR=1.98，95%CI 1.02~3.87，P=0.045）、1q21扩增（HR=2.35，95%CI 1.16~4.75，P=0.017）和13q14缺失（HR=1.93，95%CI 1.01~3.67，P=0.046）是影响初诊MM患者PFS的独立危险因素。 结论 EBV感染对初诊MM患者的疗效与预后有重要的临床意义，是不良预后的独立危险因素，或可成为新型的临床评估指标。

目的 调查多发性骨髓瘤（MM）患者血清热休克蛋白27（HSP27）的水平及与疾病诊断、治疗、预后的关系。 方法 回顾性队列研究。选取2021年12月1日至2023年6月30日福建医科大学附属第二医院85例初诊的MM患者，其中男43例，女42例，年龄为60（48，81）岁，检测其初诊时血清HSP27水平，并招募100名同期健康体检者作对照。分析MM患者血清HSP27水平与患者的性别、年龄、血红蛋白（Hb）、血清肌酐（Cr）、钙（Ca）、乳酸脱氢酶（LDH）、β2-微球蛋白水平（β2-MG）及骨髓浆细胞比例等常见临床指标的相关性；将85例MM患者根据疾病分型分期进行分组，比较HSP27水平在不同的MM分型、分期及治疗前后的差异；利用受试者工作特征（ROC）曲线获得初诊HSP27水平对MM患者经规范治疗后缓解的预测价值，并计算出最佳临界值。以临界值将MM患者分为高HSP27组37例，低HSP27组48例，采用Kaplan-Meier比较两组的生存期差异。 结果 初诊MM患者的血清HSP27水平高于健康体检者［（281.33±27.69）pg/ml，（52.11±8.12）pg/ml，t=73.7，P0.001］。HSP27水平与患者的MM分型、性别、年龄、Hb、血清Cr、Ca、LDH及骨髓浆细胞比例均无相关性，但与β2-MG水平呈正相关（r=0.703，P0.05）。HSP27在不同MM分期以及治疗前后有明显的水平差异；ROC曲线结果显示，血清HSP27水平对于MM患者经治疗后能否获得缓解具有一定的预测价值：敏感度为75.0%，特异度为63.8%，曲线下面积为0.720；最佳临界值为281.19 pg/ml。低HSP27水平组的生存时间长于高水平组。 结论 血清HSP27在MM中呈高表达，且水平高低与MM的病情、治疗及预后相关。

目的 建立人外周全血髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSC）流式细胞学检测方案及上海地区健康成年人参考区间。 方法 采用观察性研究中的横断面研究方法，利用荧光标记抗体CD45、CD3、CD19、CD123、CD56、CD16、HLA-DR、CD33、CD11b、CD14、CD15、CD20，设计人外周全血8色12参数流式细胞仪MDSC检测方案。纳入符合本研究健康标准条件的2024年5月8日至12月2日同济大学附属上海市东方医院健康体检者246名为研究对象，使用乙二胺四乙酸二钾抗凝真空管采集外周静脉全血进行MDSC检测，使用基于单平台流式细胞术的相对计数技术量化各MDSC亚群百分比。Kolmogorov-Smirnov（K-S）检验标本分布情况，Mann-Whitney U检验和Kruskal Wallis（K-W）检验评估是否需按性别或年龄分别建立参考区间并验证。根据MDSC临床意义取双侧参考区间，采用非参数法分别取百分位数P2.5和P97.5表示参考下限及参考上限秩次，四舍五入保留3位小数。 结果 设计门控策略排除粒细胞、淋巴细胞系细胞及自然杀伤细胞，对同济大学附属东方医院246名健康体检受试者MDSC水平进行检测，K-S检验结果显示健康人群MDSC各群细胞呈正偏态分布。U检验显示总髓源性抑制细胞（T-MDSC）及多形核髓源性抑制细胞亚群（PMN-MDSC）性别分布差异具有统计学意义（P0.05）。K-W检验显示21~30岁、30~40岁、40~50岁以及50~60岁年龄组各群MDSC差异无统计学意义。T-MDSC参考区间0.056%~0.485%；PMN-MDSC参考区间0.035%~0.406%；单核样髓源性抑制细胞亚群（M-MDSC）参考区间0.000%~0.221%；早期阶段髓源性抑制细胞（E-MDSC）参考区间0.004%~0.125%。对20名符合本研究健康标准条件的健康人进行参考区间验证，通过率100%。 结论 基于流式细胞术单平台方法建立了人外周全血8色12参数流式细胞仪MDSC检测方案，建立了上海地区健康成年人流式细胞术外周血MDSC参考区间。

目的 探讨β地中海贫血合并α珠蛋白基因三联体的临床表型及血液学特征。 方法 采用回顾性病例分析研究，以南华大学附属郴州市第一人民医院2021年8月10日至2023年12月31日门诊就诊检测地中海贫血个体为研究对象，其中男性8 768例，女性11 707例，年龄31.5（23.0，46.0）岁。采用血细胞分析仪进行血液学分析，毛细管电泳法进行血红蛋白（Hb）A、Hb A2、Hb F带分析，采用高通量测序技术进行地中海贫血基因分析，不同地中海贫血基因型之间的血液学参数采用t检验及校准t检验进行数据分析。 结果 检出β地中海贫血合并α珠蛋白基因三联体共27例，11例βCodon41/42（-CTTT）/βN合并αααanti4.2（3.7）平均血红蛋白（Hb）（92±16）g/L低于βCodon41/42（-CTTT）/βN（112±11 g/L），差异有统计学意义（t=3.97，P0.05），8例βIVS-II-654（CT）/βN合并αααanti4.2（3.7）平均Hb（85±21）g/L低于βIVS-Ⅱ-654（CT）/βN（116±12）g/L，差异有统计学意义（t=4.05，P0.05）。 结论 当Codon41/42（-CTTT）、IVS-Ⅱ-654（CT）位点突变的β地中海贫血合并α珠蛋白基因三联体的基因型会使该位点β地中海贫血的临床表现更加明显。

患者男，71岁，1月余前无明显诱因出现腹痛伴胸闷、气短，胃周多发异常淋巴结肿大收治河北医科大学第二医院血液内科。入院后查体贫血貌，血清免疫固定电泳显示免疫球蛋白A（IgA）、κ轻链阳性，骨髓细胞形态学、骨髓活检及淋巴结流式细胞术检查均提示大量浆细胞增生，临床初步诊断多发性骨髓瘤。骨髓细胞形态学复审发现少量异常细胞，指引临床下一步诊疗方向，行淋巴结病理活检、免疫组织化学染色及基因检测，该患者最终诊断为血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）伴单克隆免疫球蛋白血症。临床给予西达本胺+CHOPE方案化疗后，患者症状较前好转，治疗有效。AITL属于结节性滤泡辅助T细胞淋巴瘤的一个亚型，是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤。骨髓细胞形态学、淋巴结病理活检及免疫组化为该患者正确诊疗提供了重要依据和思路。

患者男，75岁，“反复咳嗽半年”，伴夜间发热、盗汗、乏力、体重减轻等症状，于2024年6月在哈尔滨医科大学附属第二医院就诊。入院后行胸部CT、支气管镜取病理初步诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），进一步行PET-CT、骨髓活检、免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）等检查综合诊断为MYD88基因异常的DLBCL伴骨髓不一致性受累。立即给予患者R-CHOP一线方案治疗，患者出现利妥昔单抗过敏，改用泽贝妥单抗仍然过敏，后更改治疗方案为CDOP继续化疗获得缓解后顺利出院，并定期入院使用G-CHOP方案进行规范化疗，过程中未见不良反应。

结直肠癌是严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤。小细胞外囊泡（sEV）是一类直径小于200 nm具有脂质双分子层结构的细胞外囊泡。小细胞外囊泡通过多种组成成分介导细胞间的信息交换。其中包括微小RNA（miRNA），长链非编码RNA（lncRNA），环状RNA（circRNA）和蛋白在内的组分参与调控结直肠癌的发生发展，并在结直肠癌的诊断及预后中发挥重要作用。sEV的多种活性成分在结直肠癌“诊断-治疗-预后”中具有应用价值，为其应用前景提供了参考。

为实现癌症的早期诊断、精准治疗及预后评估，各种癌症生物标志物的检测方法层出不穷。酶联免疫吸附试验等方法已在全球范围内投入使用，但受限于传统方法的分子水平、灵敏程度、应用范围等，难以标准化广泛应用。2014年，超灵敏单分子阵列技术突破传统方法在小分子检测方面的局限性，以更高的检测效能实现多个领域生物标志物的定量分析，为癌症生物标志物的检测打开新思路。单分子阵列技术在检测癌症生物标志物方面具有显著优势，在肺癌、乳腺癌等多种癌症的诊疗中有广泛的临床应用前景，为癌症预测模型的构建提供理论依据。