2005年 · 第28卷第05期

近半个世纪以来,以DNA双螺旋结构、DNA重组技术以及人类基因组学为标志的分子生物学的蓬勃发展,带动了整个生命科学乃至相关学科的发展,成为生物学的带头学科.分子生物学的理论与技术引进并渗透进结核病的多个领域,促进了结核病分子生物学的兴起与发展 [1,2] .近20年来,集中反映在以下5个方面取得了进展。

目的 建立结核分枝杆菌散在分布重复单位 (mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)基因型分型法,评估该方法在我国应用的可行性.方法采用简单数字表法随机抽取上海地区2000年至2002年保存的菌株,对其进行MIRU分型,并与间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)的结果进行比较.结果用Spoligotyping方法对随机抽样的91株临床菌株进行基因型分型,得到20种基因型,其中81株(89%)属于北京基因型菌株,而用MIRU分型方法可将这些菌株分为46种基因型.81株北京基因型菌株可以分为39种不同的MIRU基因型.12个MIRU位点的多态性分析表明各位点有较大的区别,其中位点26显示了较高的多态性,位点16、31、40显示了中等程度的多态性.结论 MIRU分型方法简单快速,其数字化结果清晰可靠,是一种有效的结核分枝杆菌基因型分型方法.

目的 基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术,建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法,并探讨其临床应用价值.方法设计一对聚合酶链反应(PCR)引物,其中一引物经生物素化修饰,PCR扩增含耐药决定区一297 bp 长的rpoB基因片段,借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物.设计2个正向测序引物,运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定.通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析,评价所建立方法的检测敏感性.通过对已知耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株进行分析,评价所建立方法的检测特异性.结果 PCR扩增后,可在2 h内得到耐药决定区序列.所建立方法的检测灵敏度为 50 fg DNA/反应.在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变,而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变.结论所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测。

目的 探讨免疫相关基因在结核病患者体内的差异表达.方法应用基因芯片技术和生物信息学方法,对63例单纯结核性胸膜炎患者胸腔积液及其外周血中单核细胞与69例肺癌患者的癌性胸腔积液和其外周血中单核细胞的mRNA表达水平进行分析比较,所做的表达谱杂交检测均重复1次并在荧光交换后再重复1次以抑制噪声,对阳性和部分阴性结果进行northern blotting复验.结果在对基因表达谱原始数据进行标准化校正、聚类分析和统计学处理后,发现在626条免疫相关基因中差异表达基因53条,其中与细胞增殖相关的基因16个,与细胞免疫应答相关的基因14个,与信号传导有关的基因20个,其他相关基因3个;在结核病患者胸腔积液淋巴细胞中tnf-Α、iglλ、il-17、il-17r、hla-dp、lcp1、tcrΑ、tcrΒ、hsp75、cxcr4、fyb、hla-g、hla-a、il18bp、il-2r、lt-Β、il-8、ip-10、mcp-1、il-12、 il-12r、il-10、canx、irf2、 ifn-Γ、tlr、il-1、 il-7、tlr、lsp-1、il-14共31个基因表达较对照组增高4倍以上,il-4、il-18、il-15、ifg-1、scya14、ablim、peci、ppid、hsf2、actg2、 maoa、 ttid、gatm、tgfb3、insr、thbd、trap1、 tcrΓ、tcrΔ、il-13r、il-11、igf1、a2m共22个基因表达水平较对照组降低4倍以上.结论机体抗结核免疫的发生、发展涉及多基因改变,tnf-Α、il-17、il-12 、tcrΑ、tcrΒ、hsp75、cxcr4以及 il-4、il-18、il-15等免疫相关基因差异变化显著,提示其或许可以为结核病临床生物治疗、辅助诊断和患者免疫水平评价提供参考。

目的 探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL-12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制.方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL-12治疗组,pcD85B、pcDMPT64、pcD85B+pcDMPT64、pcD85B+ psIL-12DNA疫苗治疗组.感染4周后分别给予生理盐水、空质粒、psIL-12及DNA疫苗,第1次治疗后2个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞特异性γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平,并于第1次治疗后2个月、5个月观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 pcD85B治疗组肺组织荷菌量(lg-1CFU/g)为6.99±0.40,比生理盐水对照组(8.15±0.37)、pCDNA3.1对照组(8.19±0.29)显著降低(P<0.01);脾组织荷菌量(lg-1CFU/g,±s)为5.17±0.33,比生理盐水对照组(5.76±0.16)及空质粒对照组(5.88±0.21)显著降低(P<0.05).psIL-12治疗组的肺(7.41±0.50)、脾(5.31±0.21)荷菌量比对照组显著降低(P<0.05 );pcD85B+ psIL-12治疗组肺、脾荷菌量与pcD85B组比较差别无统计学意义.pcD85B组脾淋巴细胞IFN-γ、TNF-α水平比对照组显著升高(P<0.05),各组间IL-4水平差异无统计学意义.生理盐水对照组、pCDNA3.1对照组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,增生改变不明显;Ag85B DNA疫苗组病变范围局限,并有类上皮细胞、纤维母细胞等结核结节组成细胞出现.对照组与治疗组间比较脾脏病理改变不明显.结论 Ag85B DNA疫苗对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,可能通过增强宿主Th1型免疫反应,诱导TNF-α、IFN-γ共同升高达到治疗目的;IL-12质粒单独用于小鼠结核病有一定的治疗作用,但并不能促进Ag85B DNA疫苗的免疫治疗作用。

目的 研究确定呼吸重症监护室(RICU)内机械通气患者连续发生嗜麦芽窄食单胞菌(pma)感染为暴发感染,并追踪其感染源.方法收集2002年12月至2003年2月自RICU有创机械通气患者气道抽吸物中分离出的9株pma菌株,RICU工作人员手拭子分离的pma菌株2株,纤维支气管镜(已按常规消毒存放,用于气道管理)冲洗液分离的pma菌株 2株,采用WHONET5软件通过耐药分析组合对菌株进行抗生素型分析,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)全DNA指纹图技术对菌株进行分子分型,确定菌株的亲缘关系.以1997年至2000年自多个科室收集的16株pma作对比.结果 9例机械通气患者感染的9 株pma,有8 株PFGE基因型相同,并与2株分离自RICU工作人员手拭子的pma和2株分离自纤维支气管镜的pma 基因型一致.抗生素型则有7株分型相同.抗生素型与PFGE基因型的符合率为85%(11/13).1997年至2000年收集的16株pma, PFGE基因型分为11型,抗生素型分为9型,呈现为多克隆构成模式.结论 8例机械通气患者感染的pma来自于同一克隆,RICU内存在着pma的暴发感染.消毒不彻底的纤维支气管镜和医护人员的手污染是引起本次暴发感染的重要感染源和感染途径。

目的 通过腺病毒载体介导小鼠γ干扰素(mIFN-γ)在小鼠肺脏转基因表达,探讨其对卵白蛋白(OVA)诱导过敏小鼠模型的治疗作用及其机制.方法 48只BALB/c小鼠,按随机数字表法分为7组,即阴性对照组(A组)、过敏模型组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(B、D和F组)、转基因治疗组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(C、E和G组).除A组外,B、C、D、E、F、G各组在第0天和第5天经腹腔给予OVA(每只15 μg)致敏,第12～14天经气道吸入0.5%的OVA雾化液激发(20 ml/次),建立过敏模型.第15天C、E、G组小鼠经鼻滴入50 μl带有mIFN-γ基因的复制缺陷型腺病毒(AdCMVmIFN-γ)悬液[每只5×109/空斑形成单位(PFU)],A、B、D、F组小鼠经鼻滴入50 μl生理盐水作为对照.第18天处死A、B、C组小鼠,第21天处死D和E组小鼠,第25天处死F和G组小鼠,获取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类计数,其上清液用酶联免疫吸附法测定mIFN-γ的浓度,右肺用4%多聚甲醛固定及苏木精-伊红(HE)染色,左肺组织提取总RNA,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)了解肺组织中白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13和IL-18的表达.结果 (1)经鼻给予AdCMVmIFN-γ后,BALF中可测得mIFN-γ的高效表达,C组第3天为(729.0±104.7)pg/ml, E组第6天为(984.5±119.1)pg/ml,G组第10天为(310.6±59.7)pg/ml.(2)B、C、D、E、F、G组小鼠BALF中的细胞总数分别为(318±41)×103/ml和(137±12)×103/ml、(183±23)×103/ml和(92±6)×103/ml、(196±7)×103/ml和(98±15)×103/ml,嗜酸粒细胞(EOS)构成比分别为0.715±0.054和0.452±0.016、0.393±0.065和0.083±0.038、0.253±0.035和0.068±0.025,B组和C、D和E、F和G组间细胞总数及EOS构成比比较差异均有统计学意义(P<0.01).(3)转基因治疗组病理切片可见炎症细胞浸润明显减少,气道上皮损害明显减轻.(4)D、E组肺组织中IL-10 mRNA丰度与内参之比分别为0.14±0.10和0.49±0.27;IL-12分别为0.15±0.05和0.63±0.17;IL-13分别为0.76±0.17和0.37±0.10,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);F、G组肺组织中IL-10 mRNA丰度与内参之比分别为0.13±0.04和0.27±0.17; IL-12分别为0.14±0.05和0.35±0.21;IL-13分别为0.57±0.24和0.30±0.09,两组比较差异有统计学意义(P分别=0.019、0.006、0.003).而IL-4、IL-5、IL-6和IL-18等细胞因子的表达在B、D、F组和C、E、G组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 (1)以腺病毒为mIFN-γ转基因载体,经气道给予过敏模型小鼠可以有效抑制变应原诱导的以EOS为主的炎性细胞在肺内的浸润.(2)mIFN-γ在小鼠气道的转基因表达对过敏模型小鼠治疗的作用机制,除了mIFN-γ的直接作用外,还通过上调IL-12和IL-10及下调IL-13的表达等机制来实现。

目的 研究降脂药辛伐他汀对支气管哮喘(简称哮喘)外周血嗜酸粒细胞(EOS)凋亡的影响及其机制.方法分离10例患者外周血EOS,加入不同浓度辛伐他汀 (1、5、10、20 μmol/L)和甲羟戊酸(MVA,100 μmol/L)进行体外培养,并以0 μmol/L辛伐他汀作为空白对照组,用流式细胞术检测EOS凋亡,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测EOS活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)水平.结果 (1)EOS与辛伐他汀(5 μmol/L)共同孵育6、12、24、48 h凋亡率分别为(32±4)%、(47±7)%、(62±9)%、(86±14)%,对照组分别为(23±3)%、(24±3)%、(41±6)%、(70±12)%,两组在同一时点比较差异有统计学意义(P=0.000).(2)EOS体外培养12 h,1 μmol/L辛伐他汀即可促进EOS凋亡, 此作用在5 μmol/L时达最大效应. 1、5、10、20 μmol/L辛伐他汀共培养EOS凋亡率分别为(37±3)%、(51±3)%、(53±4)%、(52±4)%, 与空白对照组[ (24±3)%]比较差异也有统计学意义 (P=0.000).(3)活化caspase-3水平变化与EOS凋亡率一致.EOS体外培养12 h时 1、5、10、20 μmol/L辛伐他汀共培养分别为(14±4) μg/L、(22±4) μg/L、(24±4)μg/L、(23±5) μg/L,与空白对照组[(8±3) μg/L]比较,差异有统计学意义(P=0.000～0.003).(4)辛伐他汀可促进EOS凋亡及增加EOS活化caspase-3水平的作用可被MVA完全阻断,体外培养12 h, EOS凋亡率在空白对照组、20 μmol/L辛伐他汀组、20 μmol/L辛伐他汀+MVA组(100 μmol/L)分别为(24±3)%、(52±4)%、(25±3)% , 活化caspase-3分别为(8±3) μg/L、(23±5) μg/L和(9±3) μg/L.结论辛伐他汀可能通过抑制类异戊二烯通路,干扰Ras蛋白的法呢基化,促进哮喘患者外周血EOS凋亡。

研究发现,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者在激烈运动后,并不出现膈肌疲劳[1,2],提示COPD患者在运动时可能存在着呼吸中枢的反馈抑制以防止呼吸肌疲劳.要证明这一假设就必须准确地评价中枢驱动.膈肌肌电可能是评价中枢驱动的一个好方法.研究提示多导食道电极记录的膈肌肌电能有效地反映正常人的呼吸中枢驱动[3,4].我们运用多导食道电极记录膈肌肌电,观察COPD患者在CO2重复呼吸及运动过程中膈肌肌电的变化,以探讨其是否存在呼吸中枢反馈抑制现象。

急性肺损伤(ALI)的基本特征是肺内微血栓形成和大量的白细胞(PMN)浸润[1].PMN表面的黏附分子CD11/CD18在PMN功能变化及ALI形成中发挥了重要作用.丹参酮ⅡA(TanⅡA)具有抗凝、抗氧化、抗炎、抗黏附作用,但应用于ALI尚少见报道。

结核病是一种严重影响人类健康的传染病.全球有近1/3人口感染了结核分枝杆菌,主要分布在发展中国家.如果不能及时和有效地控制结核病传播,在今后20年内,发展中国家将会有2亿人罹患结核病.在我国,三分之一人口已感染结核分枝杆菌,受感染人数超过4亿,其中约有10%发生结核病.如果不采取有效的措施,在未来十年内预计有3 000万人发生结核病.当前结核病控制面临的主要困难有:贫困人口的结核病发病率高、发现率低、耐药结核菌感染增多,而伴随着城市化过程的人口流动,更加剧了结核病在人群间的传播.为了有效地控制结核病传播,除了在全国范围内实施面向贫困人群的结核病控制专项项目外,还需建立完整、准确的结核病流行病学监测体系.分子流行病学是监测传染病传播的有效途径,它是建立在"感染相同菌株的患者有相同的传染源即存在分子流行病学联系"假设基础之上的,而分子流行病学在结核病基因分型中的应用,与传统流行病学相比能更准确地预测疾病的暴发流行及其传播模式。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种可预防和治疗的疾病,以气流限制不完全可逆为特征。

患者女性,15岁,因口唇发绀15年,加剧2年于2002年6月7日入院.患者自幼出现口唇发绀,无胸闷、心悸,无喜蹲踞,无咳嗽、气急,未就医.近2年来活动后发绀加重,并出现气促,到胸心外科就诊.心脏彩超示:心脏各房室未见明显异常,未见右向左分流征象,遂转入我科。

肺癌的发病率逐年升高,确诊时70%～80%患者为中晚期,丧失了手术完全切除的机会,只能依赖全身化疗、局部放疗、免疫治疗等手段,总的2年生存率低.全身化疗的选择性差,并有免疫、骨髓抑制等严重不良反应;体外放疗正常肺组织损伤、放射性肺炎的发生率高达80%以上,影响患者的生活质量和生存时间,单纯放疗患者5年生存率仅3%～5%.中、晚期中央型肺癌患者,病变位于近端支气管,远端肺组织的结构和功能是正常的.但由于肿瘤阻塞近端支气管导致阻塞性肺炎或肺不张,最终使远端肺组织功能丧失,致患者生活质量严重下降和生存时间缩短.2002年我们采用全身化疗结合支气管腔内放射治疗中、晚期中央型肺癌38例,对其近期疗效、不良反应总结报告如下。

我们通过结合高分辨率CT(HRCT)、支气管肺泡灌洗及肺功能检查、血气分析这几种检查手段,试推断结缔组织病致肺间质疾病(CTD-ILD)患者的肺部病变病理类型,以求指导临床的诊断与治疗。

患者女性,22岁,因高考体检发现右肺肿块2个月于2004年6月入院.追问病史患者2个多月前偶感活动后气急,伴轻微咳嗽、咳痰及痰中带血,无胸痛不适及无发热,不影响日常学习和生活.体检时摄X线胸片示:右下肺后近心缘处有一团块影.心脏超声示:无异常.胸部CT示:右下后纵隔囊性占位性病变,考虑纵隔肿瘤.患者既往史、个人史、家族史均无特殊.入院体检:皮肤巩膜无黄染,锁骨上淋巴结未触及,甲状腺Ⅱ°肿大,未触及结节,未闻及血管杂音.两肺呼吸音清,未闻及干湿啰音.心、腹部体检无异常体征.实验室检查:血、尿、便常规、红细胞沉降率、血生化、血清肿瘤标记物指标均正常,血抗结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)抗体、PPD皮试、乙型肝炎病毒标记物和丙型肝炎抗体检测均阴性.甲状腺B超示:甲状腺肿大,无结节。

患者女性，22岁，因高考体检发现右肺肿块2个月于2004年6月入院。追问病史患者2个多月前偶感活动后气急，伴轻微咳嗽、咳痰及痰中带血，无胸痛不适及无发热．小影响日常学习和生活，体检时摄X线胸片示：右下肺后近心缘处有一团块影。心脏超声示：无异常。胸部CT示：右下后纵隔囊性占位性病变，考虑纵隔肿瘤。患者既往史、个人史、家族史均无特殊。

一、康尼峡的概念 康尼峡缩小提示肺尖有病变,请问什么是康尼峡?

吴友根医师提出的几个问题都是肺结核诊治工作中可能经常遇到的,有实际意义,今答复如下,与您共同讨论。

编者按本期刊出何权瀛教授的一封读者来信,信中提出了一个临床上非常常见的问题,即如何对慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘(简称哮喘)这两种气道慢性炎症性疾病进行鉴别诊断。