目的 构建甲状旁腺激素(PTH)基因的重组真核表达质粒,评价体外转染后PTH基因的表达与生物学活性,同时观察其对甲状旁腺功能减退动物的基因治疗作用.方法 (1)从人胚甲状旁腺组织中克隆PTH基因,拓扑法构建其重组真核表达质粒pcDNA3.1-PTH-GFP(pcDPG),并采用酶切、聚合酶链反应(PCR)及DNA测序鉴定;(2)用脂质体转染pcDPG 入293细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并计算转染率,同时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证PTH基因的表达;(3)纯化转染细胞上清中PTH蛋白,进行生物学活性鉴定;(4)建立甲状旁腺功能减退症的家兔模型,将pcDPG质粒以肌肉注射进行分组治疗,监测血钙、磷和PTH值及存活时间,通过形态学观察各器官的病理变化.结果 (1)酶切与PCR结果与预期相同,测序结果与文献中序列同源性为99.3%;(2)细胞转染后24 h即可见GFP表达,随时间延长而表达增强,48 h转染率达38.9%和62.5%,同时RT-PCR见PTH基因表达;(3)纯化的PTH蛋白可对抗甲状旁腺切除小鼠的抽搐症状;(4)模型兔术后第2 d血钙(1.71mmol/L±0.09 mmol/L,1.73 mmol/L±0.03 mmol/L,1.75 mmol/L±0.03 mmol/L,1.65 mmol/L±0.04 mmol/L)明显低于术前(2.82 mmol/L±0.21mmol/L,P<0.05),术后第2 d PTH值(5.03 pg/ml±0.05 pg/ml, 5.04 pg/ml±0.05 pg/ml, 5.03 pg/ml±0.07 pg/ml, 5.29 pg/ml±0.03 pg/ml)也明显低于术前(11.63 pg/ml±1.60 pg/ml),但是术后第2 d血磷增高(P<0.05),pcDPG质粒大、中剂量组治疗后48 h血钙、磷与PTH值均恢复至正常.结论脂质体介导的质粒pcDPG体外转染率较高,能表达有活性的PTH蛋白,同时对甲状旁腺功能减退家兔有较好的疗效,从而为甲状旁腺功能减退症基因治疗的进一步研究奠定了基础。
