2013年 · 第36卷第02期

在分子诊断技术快速发展的今天，检验科如何利用自身专业的优势把握机遇，在分子诊断领域抢占制高点，是作为检验科管理者必须面临的课题。行业从业人员应当了解临床分子诊断技术发展的现状、准确把握临床医疗实践对分子诊断及个体化医学的需求，建立完善的分子诊断技术平台，培养技术专业的从业人员，同时建立标准化的分子诊断检测流程和质量控制体系;根据临床医生对疾病与分子靶标的需求，开展能够满足疾病诊断和治疗的临床分子诊断项目，快速地建立分子诊断技术平台。（中华检验医学杂志,2013,36:100-104）

根据CAP和IS015189认可的要求，从不同认可体系对方法学验证要求的异同、确证和验证试验的差异、方法学验证的基本要素和方法学验证的步骤等方面探讨临床分子诊断的方法学验证及其要素。（中华检验医学杂志,2013,36:105-108）

为了落实三部委《关于规范医疗服务价格管理及有关问题的通知》精神，推进公立医院医改进程，促进医院检验学科的健康发展，本文阐述了学习贯彻该文件的重要意义，并提出了几点设想。(中华检验医学杂志，2013，36：97–99)

主要介绍分子诊断技术在临床微生物学检验中的应用，内容包括核酸杂交、核酸扩增、DNA测序、基因芯片和质谱技术。分子诊断技术为感染病的快速诊断、分子流行病学调查、微生物的快速鉴定、病原菌的致病性和抗生素的耐受性研究等提供了重要的检测手段。这些新技术的应用，作为传统培养法的补充，提高了检测的灵敏度、准确性和诊断效率。（中华检验医学杂志,2013,36:109-112）

生物传感器是含有生物识别元件与信号转换器的一类传感设备。它便携低耗，操作简单，可以提供快速、实时及准确的结果，因此在分子诊断领域有巨大的应用前景。本文分析了近年来生物传感器在病原微生物的分子诊断、临床药物检测以及分子遗传学诊断等方面的研究应用进展。（中华检验医学杂志,2013,36:113-116）

美国临床实验室修正法案、美国医疗机构认可联合委员会、美国病理学家协会、国际标准化组织EN15189、患者安全目标均要求临床实验室建立规范化的危急值报告制度，但囿于检测系统、方法学、患者人群、临床认知及临床能力的差异，危急值报告程序及步骤一直未能实现标准化。本文系统阐述了危急值报告政策与法规、项目选择及报告限确定、危急值识别与报告、监控与评估等研究进展，分析讨论了相关影响因素及优化路径，并在此基础上提出若干建议，供同行商榷与参考。（中华检验医学杂志,2013,36:117-122）

受益于人类基因组计划的完成和生物信息学的快速发展，临床分子诊断的应用范畴不断扩大，其在感染性疾病、遗传性疾病及肿瘤等方面得到越来越广泛的应用。在临床分子诊断中，国际标准物质的应用是实验室检验质量得到有效保证的前提。本文就当前已建立的分子诊断相关国际标准物质的研究进展做一简要综述。(中华检验医学杂志，2013，36：125–129)

生物库的建立是为了1个或多个研究目的，有组织地收集并储存人体样本及其相关信息的机构。生物库可作为基础研究成果向临床应用转化的基础平台，在疾病诊断、新药研发、疾病相关基因研究及流行病学研究中均有重要作用。转化医学的兴起促进了生物样本库的建立及发展。我们主要阐述生物样本库建立的必要性、现代生物库类型、样本质量控制、生物库构建及操作指南的现况及研究进展，以为生物库的完善提供参考。（中华检验医学杂志,2013,36:130-134）

目的评估多重连接探针扩增技术（MLPA）在脊髓性肌肉萎缩症（SMA）、DiGeorge综合征和先天性肾上腺皮质增生症（CAH）基因诊断中的应用价值。方法采集2010年2月至2011年2月期间，上海儿童医学中心门诊21例确诊为SMA、DiGeorge综合征和CAH患者及家系成员（3例SMA先证者和家系成员6人、DiGeorge综合征4例、CAH患者8例）外周血并抽提基因组DNA。通过探针和靶序列DNA杂交、连接、PCR扩增，产物经毛细管电泳分离及Gene Marker®分析软件收集分析数据，建立MLPA技术，检测SMA、DiGeorge综合征和CAH患者及携带者致病基因拷贝数，并通过传统PCR酶切法和染色体芯片分析技术验证部分MLPA检测结果。结果用MLPA技术检测3个SMA家系3例先证者SMN1基因第7和8号外显子均为0拷贝（纯合缺失），其父母均为该区域杂合缺失携带者，用传统酶切分析SMN基因扩增产物证实MLPA结果准确可靠；4例DiGeorge综合征患者中，3例患者22q11.2区域为0.5拷贝左右（杂合缺失），缺失基因均包含Tbx1等，用染色体芯片技术分析其中1例患者全基因组拷贝数变异为22q11.2区域的1.3 Mb缺失，结果与MLPA检出的拷贝数变异相符；8例CAH患者中，6例存在21-羟化酶的编码基因（CYP21A2）及相关基因C4B和CYP21A1P的不同程度杂合缺失。结论MLPA技术作为传统检测拷贝数变异技术的补充，可有效提高相对定量检测SMA、DiGeorge综合征和CAH患者及携带者致病基因拷贝数变异。（中华检验医学杂志,2013,36:136-141）

目的探讨高原地区不同糖耐量人群对应HbA1c最佳诊断切点。方法本研究属于横断面调查。（1）收集2012年1—3月昆明医学院第一附属医院就诊糖尿病（DM）患者以及糖尿病高危人群接受筛查者，共472例（男217例，女255例，年龄≥20岁，中位年龄54岁），行口服葡糖糖耐量试验（OGTT）和乳胶增强免疫比浊法测定HbA1c。（2）研究对象分为正常糖调节组（NGT）、空腹血糖调节受损（IFG）和（或）糖耐量减低（IGT）组及糖尿病（DM）组。依据受试者工作特征曲线（ROC）分别计算与IFG、IGT、DM状态对应Hb A1c最佳切点。结果NGT、IFG和（或）IGT、DM组HbA1c均值分别为（6.06±0.11）%、（6.63±0.11）%、（8.70±2.08）%，IFG和IGT状态时，对应HbA1c最佳切点分别为6.7%和6.6%；若仅以FBG或仅以2 h PG诊断DM，对应HbA1c最佳切点均为7.1%；以FBG或2 h PG任一均可诊断DM，对应HbA1c最佳切点为7.0%；以FBG并且2 h PG诊断DM，则对应HbA1c最佳切点为7.1%。结论初步探明高原昆明地区不同糖耐量人群对应HbA1c最佳诊断切点，为HbA1c进一步临床应用提供依据。（中华检验医学杂志,2013,36:142-145）

目的建立液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）测定血清胆固醇酯n-3脂肪酸（CE-n-3 FA）的方法，以进行营养监测和心血管疾病危险分析。方法本研究为方法学建立及评价。2012年1—8月征集111名北京地区健康志愿者（年龄19~72岁），其中男55名，女56名。建立各胆固醇酯（CEs）质谱测定条件，异丙醇提取血清CEs，稀释后用LC-MS/MS分析各种CEs，归一化法定量。评价新方法的精密度。用新建立的LC-MS/MS方法测定血清CE-n-3 FA含量，同时用试剂盒测定三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和超敏C反应蛋白（hs-CRP）。用Spearman相关分析CE-n-3 FA与年龄、体质指数（BMI）、TG、HDL-C、LDL-C和hs-CRP的关系。结果样本分析在5 min内完成，11种主要CEs分离良好；CE20∶5和CE22∶6平均批内CV分别为1.6%~2.3%和1.5%~2.3%，总CV分别为3.9%~7.6%和3.5%~7.4%，未见明显干扰因素。111名健康志愿者血清分析结果显示，CE20∶5和CE22∶6均呈正偏态分布（偏度分别为1.81和1.09；峰度分别为4.50和1.40），中位数分别为0.37%（0.13%~1.26%）和0.50%（0.29%~0.94%）。CE20∶5与年龄、TG、TC、hs-CRP呈正相关（P<0.05）。结论成功建立了LC-MS/MS测定血清CE-n-3 FA含量的方法，有望用于营养监测，CE-n-3 FA与心血管疾病的关系还有待进一步研究。（中华检验医学杂志,2013,36:146-150）

目的建立一种高效液相色谱（HPLC）测定血清-巨噬细胞间胆固醇净流动的方法，用以分析与动脉粥样硬化危险因素的关系。方法培养小鼠巨噬细胞J774，用含5%个体血清的培养基进行孵育8 h，HPLC测定孵育前后细胞胆固醇，计算个体血清介导的细胞胆固醇净流动，建立血清-巨噬细胞间胆固醇净流动的测定方法。2010年10至12月征集75名北京医院健康志愿者，男38例、女37例，采集空腹静脉血，用所建方法测定胆固醇净流动；Spearman相关分析胆固醇净流动与血脂、脂蛋白、超敏C反应蛋白（hsCRP）等动脉粥样硬化危险因素的关系。结果发现个体血清孵育细胞时导致细胞胆固醇内流，细胞胆固醇随培养基中血清浓度和孵育时间的增加而增多。HPLC测定细胞胆固醇净流动的平均批内变异和总变异分别为0.81%~4.03%和4.25%~6.58%。75例健康志愿者胆固醇净流动均值为10.27μg/mg蛋白，标准差2.69μg/mg蛋白，中位数10.12μg/mg蛋白。胆固醇净流动与血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、hsCRP，载脂蛋白（Apo）CⅡ、ApoCⅢ、小而密低密度脂蛋白胆固醇（LDLb-C）、高密度脂蛋白（HDL）胆固醇摩尔酯化速率（MERHDL）（P<0.001），HDL胆固醇分数酯化速率FERHDL、Preβ-HDL（P<0.01）等呈显著正相关，但与HDL及其亚类胆固醇无相关性（P>0.05）。结论本研究建立了血清-巨噬细胞间胆固醇净流动的细胞分析体系和HPLC准确测定净流动的方法，为进一步研究血清-巨噬细胞间胆固醇净流动、HDL功能评价和心血管病危险分析提供了方法学基础。（中华检验医学杂志,2013,36:151-155）

目的探讨脂蛋白相关磷脂酶A2的酶活性水平及I198T多态性是冠心病的危险因素。方法采用病例对照研究，应用Taq Man-ARMS PCR方法，以2009年10月至2010年5月北京大学人民医院398例冠心病患者（CAD组）为病例组，与病例组年龄、性别相匹配的396例非冠心病对照组（NCAD组）为对照组，检测其PLA2G7的I198T基因多态性，并对Lp-PLA2的酶活性水平、胆固醇（CHO）、血糖（GLU）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、超敏C反应蛋白（Hs-CRP）、脂蛋白a Lp（a）进行测定和调查，运用独立样本t检验、卡方检验、方差分析、logistic分析对数据进行分析。结果冠心病组的Lp-PLA2酶活性水平高于非冠心病对照组（31.51 nmol·ml-1·min-1>21.31 nmol·ml-1·min-1），差异有统计学意义（F=16.40，P<0.05）；校正传统冠心病危险因子[CHO，TG，hs-CRP，Lp（a），GLU]后，Lp-PLA2酶活性的最高四分位数与最低四分位数相比，CAD的比值比（OR）为7.50（95% CI：2.34~24.05）；Lp-PLA2酶活性水平在基因型Ⅱ最高（22.68 nmol·ml-1·min-1，P<0.05），基因型TT的最低（11.35 nmol·ml-1·min-1，P<0.05），I198T点突变与冠心病的无明显关联（P>0.05）。结论Lp-PLA2的酶活性水平在冠心病患者中显著升高，是冠心病的危险因子。I198T点突变与冠心病的无明显关联。（中华检验医学杂志,2013,36:156-160）

目的分析肾功能不全患者服用羟苯磺酸钙后不同酶法血清肌酐存在较大差异的原因，探讨羟苯磺酸钙对肌氨酸氧化酶法检测肌酐的影响。方法本研究是自身前-后对照研究。（1）体内干扰实验：选取2011年5月至10月黄石市第二医院10例慢性肾脏病患者，检测服用羟苯磺酸钙服用前及服用后1周血清肌氨酸氧化酶法肌酐（Scr1）、脱亚胺酶法肌酐（Scr2）、尿素（Urea）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C），比较服药前后Scr1、Scr2、Urea、估算法GFR（eGFR）的差异。（2）体外干扰筛选实验：检测羟苯磺酸钙（100 mg/L）对Scr1及Scr2有无干扰。（3）干扰剂量效应实验：检测不同浓度羟苯磺酸钙（1.25~20.0 mg/L）对肌氨酸氧化酶法低浓度肌酐（65.9μmol/L）样品及高浓度肌酐（404.5μmol/L）样品的干扰效应。以肌酐偏差3.5%或6.63μmol/L作为干扰临床可接受标准（dmax），配对样本比较用Wilcoxonz秩和检验。结果（1）体内干扰实验：患者服药后Scr1浓度148.0μmol/L低于服药前273.5μmol/L（Z=-2.803，P<0.01），服药前、后Scr2浓度（269.5μmol/L与266.0μmol/L，Z=-0.614，P>0.05）、Urea浓度（14.2 mmol/L与14.4 mmol/L，Z=-0.563，P>0.05）及eGFR[18.95 ml·（min·1.73 m2）-1与19.35 ml·（min·1.73 m2）-1，Z=-0.570，P>0.05]差异均无统计学意义。（2）干扰筛选实验：Scr1对照样品均值404.0μmol/L，实验样品干扰值（dobs）95%置信区间（CI）为（-173.90±2.86）μmol/L，显示严重负干扰，Scr2无干扰。（3）干扰剂量效应实验：低浓度肌酐样品，干扰剂量效应回归方程Y=0.0263X2-1.6394X-0.2754（R2=0.996，F=2546.7，P<0.05），羟苯磺酸钙在3.5 mg/L浓度下干扰小于预设的dmax；高浓度肌酐样品，干扰剂量效应回归方程Y=-2.7649X-0.0782（R2=0.998，F=7943.4，P<0.05），羟苯磺酸钙在4.4 mg/L浓度下干扰小于预设的dmax。结论羟苯磺酸钙对肌氨酸氧化酶法检测肌酐有负干扰，是肾功能不全患者用药后不同酶法结果差异的原因，建议服用羟苯磺酸钙的肌酐结果在临床评价时需加以高度警惕，有条件时选用其他原理的肌酐测定法复核。（中华检验医学杂志,2013,36:161-164）

目的探讨肺癌患者血清/外周血单个核细胞（PBMC）microRNA（miRNAs）表达谱的变化及其意义。方法本研究属于临床病例对照研究。建立基于实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测miRNA的方法，对其进行定量研究；2011年11月至2012年9月收集苏州大学附属第一医院住院及门诊肺癌患者61例，肺部良性疾病及健康对照各48例，各组间性别、年龄匹配，年龄为64（40~85）岁；采用RT-qPCR技术检测血清及配对PBMC中miR-20a、miR-21、miR-25、miR-29a、miR-31、miR-126、miR-129、miR-145、miR-205的表达水平，以U6为内参，用F=2-ΔCt法计算。其中ΔCt=CtmiRNA-CtU6。F表示目标miRNA表达量相对于同一样本U6的变化倍数。采用SPSS 19.0软件进行统计分析，两组样本的比较采用成组设计的两样本t检验，多组数据的比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，多组数据两两间的比较采用S-N-K检验，两变量之间关系采用Pearson相关性分析，对各样本中U6的Ct值是否相等作Brown-Forsythe检验。结果肺癌患者血清miR-20a（F=271.64，P<0.01）、miR-21（F=2232.51，P<0.01）、miR-205（F=45.13，P<0.01）、miR-29a（F=19.98，P<0.01）、miR-25（F=313.19，P<0.01）、miR-126（F=32.38，P<0.01）与健康对照组、肺部良性疾病组之间差异有统计学意义，且其中miR-29a（健康对照组3.27±2.44，肺部良性疾病组3.19±0.32，肺癌组0.99±2.31）、miR-25（健康对照组3.88±0.62，肺部良性疾病组3.42±0.51，肺癌组1.79±0.37）、miR-126（健康对照组3.19±1.77，肺部良性疾病组2.67±1.55，肺癌组0.96±0.84）在肺部疾病恶性化发展中呈下调趋势；肺癌miR-31（比值=1.85，P<0.01）与健康对照相比升高，miR-145（比值=-3.00，P<0.05）则下降；不同分化程度的肺癌患者血清miR-31（F=5.22，P<0.01）表达差异有统计学意义，中分化时期（1.40±0.39）表达最高；当全身转移（特别是骨转移）时，miR-31（无转移1.16±0.40，有转移1.03±0.24，P<0.05）表达下降。在与肺癌患者血清配对PBMC中，miR-126（F=690.58，P<0.01）、miR-129（F=26.66，P<0.01）、miR-145（F=48.57，P<0.01）、miR-205（F=308.61，P<0.01）、miR-25（F=218.57，P<0.01）、miR-31（F=48.05，P<0.01）与健康对照组、肺部良性疾病组之间差异有统计学意义，且其中miR-25（健康对照组6.54±0.63，肺部良性疾病组5.82±0.51，肺癌组3.97±0.55）、miR-31（健康对照组4.26±0.43，肺部良性疾病组4.08±0.37，肺癌组3.43±0.38）在肺部疾病恶性化发展中呈下调趋势；肺癌miR-20a（比值=1.39，P<0.01）、miR-29a（比值=1.42，P<0.01）与健康对照相比均升高；当全身转移时，miR-21（无转移5.11±0.24，有转移5.28±0.24，P<0.05）表达上升；患者miR-31血清和PBMC中的表达水平呈负相关（r=-0.369，P<0.05）；血清miR-29a（S=0.968，P<0.01）、miR-25（S=0.906，P<0.01）、miR-126（S=0.969，P<0.01）的ROC曲线下面积有统计学意义。结论miRNA可能参与了肺癌转移的多个步骤，包括局部浸润、渗出血管或在远处的初步生存和转移灶生长等，也可能影响肺癌的预后。miRNA的检测可为肺癌的进展机制提供一个新的研究线索。（中华检验医学杂志,2013,36:165-172）

目的探讨实时（Real-time）PCR在侵袭性曲霉病（IA）高危患者中的诊断价值，与血清半乳甘露聚糖（GM）试验比较诊断性能。方法回顾性调查分析2008年5月至2010年12月临床疑患IA住院患者110例次，根据诊断标准将确诊IA和临床诊断IA归为感染组，共23例次，拟诊IA和非IA归为非感染组，共87例次。对其住院期间的257份血清进行Real-time PCR和GM检测，绘制Real-time PCR的受试者操作曲线（ROC），计算ROC曲线下面积，制定最佳临界值；计算单次PCR阳性在不同分级诊断中的阳性率；计算不同PCR和（或）GM诊断条件下的灵敏度（Se）、特异度（Sp）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）等。采用Mc Nemar配对χ2检验对不同方法进行比较。结果ROC曲线下面积为0.91（95% CI：0.825~0.995），最佳临界循环值为39.45。单次PCR阳性对确诊和临床诊断的诊断率分别为100%和84.2%。以单次PCR阳性、两次PCR阳性、单次GM阳性和两次GM阳性为诊断标准的Se和Sp分别为87.0%、79.3%，58.3%、97.8%，78.3%、63.2%和58.3%、82.6%。以单次、两次PCR阳性为诊断标准的Sp分别较单次、两次GM阳性显著升高（P<0.05），而Se无统计学差异；两次PCR阳性与单次PCR阳性相比Sp显著升高（P<0.05）。1次GM阳性且1次PCR阳性的Se、Sp为65.2%、89.7%；1次GM阳性或1次PCR阳性Se达100%，Sp为52.3%。结论Real-time PCR对侵袭性曲霉病具有较高的诊断价值，其灵敏度和特异度均优于GM试验；两次PCR阳诊断侵袭性曲霉病能够提高诊断的特异度和阳性预测值。（中华检验医学杂志,2013,36:173-177）

SELEX是一种新近发展起来的组合生物化学技术，即通过配基识别、结合目的靶分子从而筛选出特定靶分子的高特异性和高亲和力的配基。针对筛选获得的特异配基在临床上有多种应用，如应用于疾病的临床诊断，作为功能阻断物质开发新型的治疗药物，或直接参与阻断疾病的进程应用于临床治疗等。（中华检验医学杂志,2013,36:188-190）